克隆抗體與基因工程抗體

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1、單克隆抗體與基因工程抗體中山醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室張春艷多克隆抗體(Polyclonalantibody)一.概念給動物接種抗原所獲得的免疫血清或抗血清是多種抗體的混合物,它是由多種抗原決定簇刺激多株B細胞增殖分化所產(chǎn)生的,稱為多克隆抗體.二.多克隆抗體的應(yīng)用免疫學(xué)檢測被動免疫治療和緊急預(yù)防三.存在問題特異性差,用于免疫學(xué)檢測容易出現(xiàn)交叉反應(yīng)單克隆抗體(Monoclonalantibody,McAb)一.概念:通過B細胞雜交瘤技術(shù),獲得特異性針對某一種抗原決定簇的細胞克隆，產(chǎn)生均一性的抗體.二.B細胞雜交瘤的類型小鼠-小鼠大鼠-大鼠小鼠-人人-人三..雜交瘤技術(shù)的

2、原理1.親本細胞的選擇小鼠骨髓瘤細胞次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核苷轉(zhuǎn)移酶(HGPRT)缺陷型免疫脾細胞經(jīng)抗原免疫的BALB/c小鼠的脾臟2.細胞融合骨髓瘤細胞PEG雜交瘤細胞脾細胞融合后細胞的類型:未融合的脾細胞雜交瘤細胞未融合的瘤細胞3雜交瘤細胞的選擇性培養(yǎng)DNA合成的途徑：糖+氨基酸氨基喋呤(Aminopterin,A)TK核苷酸DNA胸腺嘧啶核苷TMP(Thymidine,T)核苷酸前體次黃嘌呤HGPRTIMP(Hypoxanthine,H)融合后細胞在HAT培養(yǎng)基中存活情況脾細胞（HGPRT+,TK+,不能長期生長）骨髓瘤細胞（HGPRT-,TK-，不能生長）雜交瘤

3、細胞（HGPRT+,TK+，能夠生長）4.雜交瘤細胞的篩選和克隆化篩選：免疫熒光ELISA等克隆化：有限稀釋法單個細胞顯微操作法軟瓊脂培養(yǎng)法5.單克隆抗體的生產(chǎn)體內(nèi)：BALB/c小鼠體內(nèi)誘發(fā)含有單抗的腹水體外：無血清培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)等6.單克隆抗體的純化硫酸銨沉淀法離子交換層析A蛋白-Sepharose親和層析四.單克隆抗體的特性高度均一性：純度很高的均一性抗體高度專一性：只對抗原分子上某一抗原決定簇起反應(yīng)大量產(chǎn)生及穩(wěn)定性：雜交瘤細胞能在體內(nèi)外無限繁殖之傳代五.單克隆抗體在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用（一）用作診斷試劑1.檢測淋巴細胞表面分子，區(qū)分不同分化階段的淋巴細胞，鑒別淋巴細胞

4、。2.鑒定病原體，準(zhǔn)確診斷傳染病。3.用于腫瘤的診斷和分型4.激素類單抗用于測定體內(nèi)激素含量，判斷內(nèi)分泌的功能狀態(tài)（二）用作研究工具純化抗原分析和探查抗原結(jié)構(gòu)分析抗原決定簇分子的功能（三）用于疾病的治療抗細胞表面分子單抗，用于移植排斥反應(yīng)的防治抗細胞因子單抗用于自身免疫性疾病的治療抗腫瘤單抗用于腫瘤的導(dǎo)向治療單克隆抗體用于免疫治療存在的問題單克隆抗體的特異性由于腫瘤特異性抗原較少，缺乏對腫瘤有嚴格特異性的單抗，對正常組織有交叉反應(yīng)異種抗體反應(yīng)鼠源性單抗用于人體，導(dǎo)致異源性超敏反應(yīng)基因工程抗體(Geneticengineeringantibody)概念：根據(jù)研究者的

5、意圖，采用基因工程方法，在基因水平，對免疫球蛋白基因進行切割、拼接或修飾后導(dǎo)入受體細胞進行表達，產(chǎn)生新型抗體。主要包括嵌合抗體、單鏈抗體、人源化抗體、雙價抗體和雙特異性抗體。一.嵌合抗體(chimericantibody)從雜交瘤細胞分離出功能性可變區(qū)基因，與人Ig恒定區(qū)基因連接，插入適當(dāng)表達載體，轉(zhuǎn)染宿主細胞，表達人-鼠嵌合抗體。特點：減少了鼠源性抗體的免疫原性，同時保留了親本抗體特異性結(jié)合抗原的能力。二.單鏈抗體(singlechainantibody)用基因工程方法，將抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)通過一個連接肽連接而成的重組蛋白。特點：能保持與抗原結(jié)合的性能，分子量小

6、，穿透性強，體內(nèi)循環(huán)半衰期短，免疫原性低。單鏈抗體的應(yīng)用：用于腫瘤的導(dǎo)向治療腫瘤的影像分布基因治療細胞內(nèi)抗體：在細胞內(nèi)表達特異性識別某一基因產(chǎn)物的抗體，可干擾該基因產(chǎn)物的生物活性。4。研究基因結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系三.人源化抗體(humanizedantibody)1.將小鼠的CDR序列移植到人抗體可變區(qū)框架中，產(chǎn)生的抗體稱為CDR移植抗體。2.將小鼠Ig基因敲除，轉(zhuǎn)染人Ig基因，在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生人Ab，再經(jīng)雜交瘤技術(shù)，產(chǎn)生大量完全人源化抗體四、雙價抗體與雙特異性抗體(bispecificantibody)許多抗原抗體反應(yīng)要求雙價的抗原結(jié)合位點，使抗原分子上的兩個表位交聯(lián)或

7、使兩個抗原分子連接。將識別腫瘤抗原的抗體和識別細胞毒性免疫效應(yīng)細胞表面分子的抗體連結(jié)在一起，可使效應(yīng)細胞更容易與腫瘤細胞結(jié)合識別，取得殺傷腫瘤細胞的作用。