克隆抗體與基因工程抗體的制備

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1、第四章單克隆抗體與基因工程抗體的制備第一節(jié)雜交瘤技術(shù)的基本原理一、雜交瘤技術(shù)二、陽性雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)與凍存第二節(jié)單克隆抗體的制備一、單克隆抗體的產(chǎn)生二、單克隆抗體的純化三、單克隆抗體的性質(zhì)鑒定四、單克隆抗體的特性第三節(jié)基因工程抗體制備一、人源化抗體二、小分子抗體三、抗體融合蛋白四、雙特異性抗體五、噬菌體抗體庫技術(shù)第四節(jié)單克隆抗體的應(yīng)用一、檢驗醫(yī)學(xué)診斷試劑二、蛋白質(zhì)的提純?nèi)?、小分子抗體的應(yīng)用四、抗體融合蛋白的應(yīng)用五、雙特異抗體的應(yīng)用六、抗體庫技術(shù)的應(yīng)用和前景思考題小結(jié)第一節(jié)雜交瘤技術(shù)的基本原理雜交瘤技術(shù)原理：聚乙二醇（PEG）：細(xì)胞融合劑，使免疫的小鼠脾細(xì)?胞與小鼠骨髓瘤

2、細(xì)胞融合HAT培養(yǎng)基的選擇培養(yǎng)：反復(fù)的免疫學(xué)檢測篩選克隆化增殖的雜交瘤?細(xì)胞系單克隆抗體生成：接種雜交瘤?細(xì)胞于小鼠腹腔，腹水中即可得到高效價的單克隆抗體抗體種類：第一代抗體多克隆抗體（polyclonalantibody)第二代抗體單克隆抗體（monoclonalantibody)第三代抗體基因工程抗體（geneticengineeringantibody)B淋巴細(xì)胞:壽命短,分泌特異系性抗體骨髓瘤細(xì)胞：壽命長雜交瘤細(xì)胞：壽命長，單克隆抗體流程一、雜交瘤技術(shù)不產(chǎn)生Ig的重鏈和輕鏈HGPRT-;TK-與提供淋巴細(xì)胞的動物品系相同（一）小鼠骨髓瘤細(xì)胞動物：BALB/c小鼠7～12

3、周齡20g～25g體重（二）免疫脾細(xì)胞細(xì)胞性抗原：（1~2）×107/只，不加佐劑，2~3周重復(fù)一次可溶性抗原：首次，完全福氏佐劑+100微克抗原，3~6周100~200微克抗原，融合前3天，加強免疫免疫小鼠。淋巴細(xì)胞。淋巴細(xì)胞發(fā)育。漿細(xì)胞?？乖臃N培養(yǎng)液：RPM1640培養(yǎng)液DMEM培養(yǎng)液（三）細(xì)胞融合細(xì)胞融合劑：PEG:分子量4000的PEG是最常用的細(xì)胞融合劑作用機理：誘導(dǎo)細(xì)胞膜上脂類物質(zhì)結(jié)構(gòu)重排，使細(xì)胞膜易打開而有助于細(xì)胞融合作用特點：隨機發(fā)生的，不同廠商、批號、分子量的PEG，其純度與毒性有所不同培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞：選擇對數(shù)生長期的細(xì)胞進行傳代培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)：渾圓、透亮、均

4、一、排列整齊避免細(xì)胞返祖：定期用8-AG處理細(xì)胞注意事項：切忌過多傳代培養(yǎng)，可將細(xì)胞分裝凍存于-80℃或液氮及干冰中免疫脾細(xì)胞的制備：1×108的淋巴細(xì)胞無菌手術(shù)飼養(yǎng)細(xì)胞：細(xì)胞密度過低不利于細(xì)胞生長繁殖常用小鼠腹腔細(xì)胞作飼養(yǎng)細(xì)胞其中MQ還有清除死亡細(xì)胞的作用飼養(yǎng)存活一般不超過2周，不影響雜交瘤細(xì)胞的純化。飼養(yǎng)細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞與淋巴細(xì)胞(1:3)50%PEG1min內(nèi)加完;2min內(nèi)加10ml培養(yǎng)液融合方法SP2/0細(xì)胞與脾細(xì)胞的比例為1：2～51ml50%的PEG（無菌，預(yù)溫37℃）在1分鐘內(nèi)滴完,靜置90秒,時間一到,將事先準(zhǔn)備的培養(yǎng)液一滴一滴加入,停止PEG作用根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加

5、入HAT培養(yǎng)基，使之分加到96孔板中時每孔細(xì)胞數(shù)為（0.5～1.5）×105個。融合后7天，換用HT培養(yǎng)液細(xì)胞融合10～20天出現(xiàn)克隆HAT篩選挑克隆融合細(xì)胞的早期培養(yǎng)HGPRT酶與TK酶：次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶胸腺嘧啶核苷激酶（四）雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)應(yīng)用液：8-雜氮鳥嘌呤聚乙二醇HAT培養(yǎng)基：H（Hypoxanthine）:次黃嘌呤A（Aminopterin）：氨基喋呤；葉酸拮抗物，阻斷DNA合成主要途徑T(Thymidine)：胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前體”，供細(xì)胞通過替代途徑合成DNAHAT選擇作用：淋巴細(xì)胞：不能生長，5~7天死亡；DNA合成的主要途徑被A阻斷骨髓瘤細(xì)

6、胞：不能生長，5~7天死亡；HGPRT缺乏，DNA合成的替代途徑受阻SP2/O:HGPRT-，TK-;長命脾細(xì)胞:HGPRT+，TK+;短命(7天)雜交瘤細(xì)胞:HGPRT+，TK+;長命骨髓瘤細(xì)胞、脾細(xì)胞與雜交瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞：長期生長繁殖利用淋巴細(xì)胞的HGPRT，將H合成為嘌呤堿并最終與T一起合成DNA從淋巴細(xì)胞獲得產(chǎn)生某種抗體的遺傳信息從骨髓瘤細(xì)胞獲得不斷繁殖的能力有限稀釋法(limitingdilution)顯微操作法(micromanipulation)FACS法（fluorescenceactivatedcellsorter）軟瓊脂平板法(softagarmethod

7、)二、陽性雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)與凍存特點：不需任何特殊設(shè)備克隆出現(xiàn)效率高實驗室常用方法方法：細(xì)胞懸液通過系列稀釋每個培養(yǎng)孔含0.5～1個細(xì)胞有限稀釋法效率最高價格昂貴FACS配制方案：雜交瘤細(xì)胞（（1～5）x106/ml)+細(xì)胞凍存液(30%～40%牛血清，50%～60%RPMI-1640培養(yǎng)液，10%DMSO)“慢凍”：分步冷凍，30℃→-70℃→液氮“快融”：取出立即浸入37℃～40℃水浴中，使其迅速融化、復(fù)蘇雜交瘤細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇防止污染避免染色體丟失防止非分泌細(xì)胞的過度生長防止細(xì)胞