蛋白分泌表達(dá),枯草芽孢桿菌來表達(dá)

《蛋白分泌表達(dá),枯草芽孢桿菌來表達(dá)》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。

1、枯草芽孢桿菌，學(xué)名Bacillussubtilis，是一種被廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的革蘭氏陽性細(xì)菌。與大腸桿菌不同，枯草芽孢桿菌沒有外層膜，分泌的蛋白能直接釋放到培養(yǎng)基中，是一種理想的原核蛋白分泌表達(dá)菌株。那么作為一種潛能巨大的原核表達(dá)系統(tǒng)，它究竟強(qiáng)在哪些方面呢？且讓AtaGenix為您一一道來。1安全可靠枯草芽孢桿菌的安全性是食品級(jí)的，收錄于FDA的GRAS菌中，歐洲食品安全局認(rèn)為枯草芽孢桿菌可用于食品發(fā)酵。很多常用食品工藝中都能見到它的身影。與大腸桿菌相比，枯草芽孢桿菌的細(xì)胞壁組成簡單，只含肽聚糖和磷壁酸，在分泌的蛋白質(zhì)產(chǎn)品中不會(huì)混雜有類似革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁成分中的熱源性脂

2、多糖（內(nèi)毒素）等物質(zhì)。該表達(dá)系統(tǒng)用于藥用蛋白的表達(dá)純化時(shí)還可省掉去除內(nèi)毒素這一步。2高產(chǎn)高效同為原核生物界的明星，雖然大腸桿菌和枯草芽孢桿菌都只需短時(shí)間就可表達(dá)和積累大量目標(biāo)蛋白。但大腸桿菌在后續(xù)發(fā)酵工藝中需要對(duì)收集的菌體進(jìn)行破胞處理，而枯草芽孢桿菌得益于其本身所擁有的一套高效分泌信號(hào)肽及分子伴侶系統(tǒng)，只要簡單處理發(fā)酵上清就能得到較純的蛋白，并且表達(dá)的蛋白在多數(shù)情況下具有天然構(gòu)象和生物活性。蛋白質(zhì)組學(xué)研究表明，枯草芽孢桿菌中至少有四種蛋白質(zhì)分泌途徑，其中Sec分泌途徑是主要分泌途徑。另外枯草芽孢桿菌擁有良好的發(fā)酵生產(chǎn)技術(shù)，目前大部分商業(yè)化的蛋白水解酶和淀粉酶都是由其發(fā)酵得到

3、的。AtaGenix擁有的5L、20L、150L及其他型號(hào)的發(fā)酵罐（上圖就是真相），可滿足各種大規(guī)模發(fā)酵的需求。雖然枯草芽孢桿菌表達(dá)外源蛋白潛力無限，但也有其短板，如自身胞外蛋白酶對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的降解、遺傳操作相對(duì)困難、外源蛋白有時(shí)得不到有效的表達(dá)等等。但AtaGenix卻能成功避免以上問題使外源目標(biāo)蛋白在枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)中有效表達(dá)，這主要得益于以下三個(gè)方面的優(yōu)勢：①豐富的表達(dá)宿主由于枯草芽孢桿菌沒有明顯的密碼子偏愛性，表達(dá)外源蛋白時(shí)無需對(duì)DNA序列進(jìn)行優(yōu)化。在不同宿主中表達(dá)時(shí)，蛋白表達(dá)情況可能有差異。在AtaGenix擁有的多種枯草芽孢桿菌表達(dá)宿主中，1012wildty

4、pe宿主菌是最常用到的，可作為胞內(nèi)和胞外表達(dá)的通用菌；168Marburg遺傳背景清楚，是研究枯草芽孢桿菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株；AS1作為胞內(nèi)表達(dá)的備用菌株，常用于表達(dá)外源蛋白。而胞外蛋白酶缺陷菌株WB800N能有效解決由于枯草芽孢桿菌豐富的蛋白酶導(dǎo)致的蛋白表達(dá)產(chǎn)物降解問題。②給力的表達(dá)載體大部分的枯草芽孢桿菌不含內(nèi)源性質(zhì)粒，并且一般不能識(shí)別大腸桿菌中的啟動(dòng)子。最初的枯草芽孢桿菌載體源于金黃色葡萄球菌，其結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定并易丟失。現(xiàn)在普遍使用的質(zhì)粒載體是由枯草芽孢桿菌隱性質(zhì)粒與大腸桿菌質(zhì)粒構(gòu)成的穿梭載體，可在大腸桿菌中完成基因片段的連接克隆等遺傳操作，然后轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌進(jìn)行外源基因的表達(dá)

5、。AtaGenix使用的pHT系列載體擁有枯草芽孢桿菌的σA-依賴性的強(qiáng)啟動(dòng)子，配以groE啟動(dòng)子和lac操縱子，能夠通過IPTG誘導(dǎo)來啟動(dòng)外源基因的表達(dá)。通過添加枯草芽孢桿菌中編碼α-淀粉酶的amyQ基因的信號(hào)肽編碼區(qū)域，構(gòu)成了能夠?qū)⒛繕?biāo)蛋白有效分泌至胞外的表達(dá)載體，如pHT43。③有效的轉(zhuǎn)化手段枯草芽孢桿菌早期比較通用的轉(zhuǎn)化方法是Spizizen轉(zhuǎn)化法（接合轉(zhuǎn)化），但在枯草芽孢桿菌的生長周期中能自發(fā)形成感受態(tài)的菌株極少，并且感受態(tài)保存時(shí)間短暫。電轉(zhuǎn)化法操作簡單并且轉(zhuǎn)化率相對(duì)較高，AtaGenix通過優(yōu)化電轉(zhuǎn)條件（上圖為AtaGenix實(shí)驗(yàn)室的電轉(zhuǎn)儀實(shí)拍），將其用于枯草芽

6、孢桿菌的轉(zhuǎn)化，可以有效縮短轉(zhuǎn)化時(shí)間并使轉(zhuǎn)化陽性率達(dá)到90%以上。與大腸桿菌相比，枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)還不是很完善，相信隨著對(duì)其研究的不斷深入，它在今后的發(fā)展中一定會(huì)大放光彩。畢竟，相對(duì)于真核表達(dá)系統(tǒng)，枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)周期短、成本低、表達(dá)量較高這些優(yōu)勢還是很吸引人的。當(dāng)然，AtaGenix也期待更多新的表達(dá)系統(tǒng)可以服務(wù)科研，造福人類。