DNA分子標(biāo)記及其優(yōu)缺點(diǎn)

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1、DNA分子標(biāo)記種類及相應(yīng)的優(yōu)缺點(diǎn)摘要: 對(duì)RFLP、RAPD、AFLP、SSR、ISSR等常用的DNA分子標(biāo)記技術(shù)以及其他幾種新興的標(biāo)記技術(shù)(SNP、EST等)的原理、特點(diǎn)進(jìn)行了綜述,并對(duì)各自的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行了探討。關(guān)鍵詞:DNA分子標(biāo)記優(yōu)缺點(diǎn)分子標(biāo)記是繼形態(tài)標(biāo)記、細(xì)胞標(biāo)記和生化標(biāo)記之后發(fā)展起來的一種較為理想的遺傳標(biāo)記形式,它以蛋白質(zhì)、核酸分子的突變?yōu)榛A(chǔ),檢測(cè)生物遺傳結(jié)構(gòu)與其變異。分子標(biāo)記技術(shù)從本質(zhì)上講,都是以檢測(cè)生物個(gè)體在基因或基因型上所產(chǎn)生的變異來反映生物個(gè)體之間的差異。每一種分子標(biāo)記都有其自身的特點(diǎn)和特定的應(yīng)用范圍,但就一般意義而言,

2、DNA分子標(biāo)記與形態(tài)標(biāo)記和生化標(biāo)記等相比,具有許多獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn):①不受組織類別、發(fā)育階段等影響。植株的任何組織在任何發(fā)育時(shí)期均可用于分析。②不受環(huán)境影響。因?yàn)榄h(huán)境只影響基因表達(dá)(轉(zhuǎn)錄與翻譯),而不改變基因結(jié)構(gòu)即DNA的核苷酸序列。③標(biāo)記數(shù)量多,遍及整個(gè)基因組。④多態(tài)性高,自然存在許多等位變異。⑤有許多標(biāo)記表現(xiàn)為共顯性,能夠鑒別純合基因型和雜合基因型,提供完整的遺傳信息。⑥D(zhuǎn)NA分子標(biāo)記技術(shù)簡(jiǎn)單、快速、易于自動(dòng)化。⑦提取的DNA樣品,在適宜條件下可長(zhǎng)期保存,這對(duì)于進(jìn)行追溯性或仲裁性鑒定非常有利。因此,DNA分子標(biāo)記可以彌補(bǔ)和克服在形態(tài)學(xué)鑒定及

3、同工酶、蛋白電泳鑒定中的許多缺陷和難題,因而在品種鑒定方面展示了廣闊的應(yīng)用前景。1.1 第1代分子標(biāo)記1.1.1 RFLP標(biāo)記技術(shù)。1980年Botesin提出的限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(Restrictionfragmentlengthpolymorphisms,RFLP)可以作為遺傳標(biāo)記,開創(chuàng)了直接應(yīng)用DNA多態(tài)性的新階段,是最早應(yīng)用的分子標(biāo)記技術(shù)。RFLP是檢測(cè)DNA在限制性內(nèi)切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小,反映DNA分子上不同酶切位點(diǎn)的分布情況,因此DNA序列上的微小變化,甚至1個(gè)核苷酸的變化,也能引起限制性內(nèi)切酶切點(diǎn)的丟失或產(chǎn)

4、生,導(dǎo)致酶切片段長(zhǎng)度的變化。優(yōu)點(diǎn):RFLP標(biāo)記的等位基因具有共顯性的特點(diǎn),結(jié)果穩(wěn)定可靠,重復(fù)性好,特別適應(yīng)于構(gòu)建遺傳連鎖圖。缺點(diǎn):在進(jìn)行RFLP分析時(shí),需要該位點(diǎn)的DNA片段做探針,用放射性同位素及核酸雜交技術(shù),既不安全又不易自動(dòng)化。另外,RFLP對(duì)DNA多態(tài)性檢出的靈敏度不高,RFLP連鎖圖上還有很多大的空間區(qū)。1.1.2 RAPD標(biāo)記技術(shù)。為了克服RFLP技術(shù)上的缺點(diǎn),Williams等于1990年建立了隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA(RandomamplifiedpolymorphicDNA,RAPD)技術(shù),由于其獨(dú)特的檢測(cè)DNA多態(tài)性的方式使

5、得RAPD技術(shù)很快滲透于基因研究的各個(gè)領(lǐng)域。RAPD是建立于PCR基礎(chǔ)之上的分子標(biāo)記技術(shù),基本原理是利用一個(gè)隨機(jī)引物(8~10個(gè)堿基)通過PCR反應(yīng)非定點(diǎn)地?cái)U(kuò)增DNA片段,然后用凝膠電泳分離擴(kuò)增片段來進(jìn)行DNA多態(tài)性研究。對(duì)任一特定引物而言,它在基因組DNA序列上有其特定的結(jié)合位點(diǎn),一旦基因組在這些區(qū)域發(fā)生DNA片段插入、缺失或堿基突變,就可能導(dǎo)致這些特定結(jié)合位點(diǎn)的分布發(fā)生變化,從而導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量和大小發(fā)生改變,表現(xiàn)出多態(tài)性。優(yōu)點(diǎn):與RFLP相比,RAPD技術(shù)簡(jiǎn)單,檢測(cè)速度快,DNA用量少,實(shí)驗(yàn)設(shè)備簡(jiǎn)單,不需DNA探針,設(shè)計(jì)引物也不需

6、要預(yù)先克隆標(biāo)記或進(jìn)行序列分析,不依賴于種屬特異性和基因組的結(jié)構(gòu),合成一套引物可以用于不同生物基因組分析,用一個(gè)引物就可擴(kuò)增出許多片段,而且不需要同位素,安全性好。缺點(diǎn):當(dāng)然,RAPD技術(shù)受許多因素影響,實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性和重復(fù)性差,首先是顯性遺傳,不能識(shí)別雜合子位點(diǎn),這使得遺傳分析相對(duì)復(fù)雜,在基因定位、作連鎖遺傳圖時(shí),會(huì)因顯性遮蓋作用而使計(jì)算位點(diǎn)間遺傳距離的準(zhǔn)確性屬特異性和基因組的結(jié)構(gòu),合成一套引物可以用于不同生物基因組分析,用一個(gè)引物就可擴(kuò)增出許多片段,而且不需要同位素,安全性好。當(dāng)然,RAPD技術(shù)受許多因素影響,實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性和重復(fù)性差,首先

7、是顯性遺傳,不能識(shí)別雜合子位點(diǎn),這使得遺傳分析相對(duì)復(fù)雜,在基因定位、作連鎖遺傳圖時(shí),會(huì)因顯性遮蓋作用而使計(jì)算位點(diǎn)間遺傳距離的準(zhǔn)確性下降;其次,RAPD對(duì)反應(yīng)條件相當(dāng)敏感,包括模板濃度、Mg2+濃度,所以實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性差。1.1.3 AFLP標(biāo)記技術(shù)。擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)技術(shù)(AFLP),又名限制片段選擇擴(kuò)增技術(shù)(Selectiverestrictionfragmentamplifi2cation,SRFA),于1993年由荷蘭KEYGENE公司的Zabean和Vos等發(fā)明,并已申請(qǐng)專利。AFLP是近年來迅速發(fā)展起來的一種分子標(biāo)記技術(shù),它將基因組

8、DNA用成對(duì)的限制性內(nèi)切酶雙酶切后產(chǎn)生的片段用接頭(與酶切位點(diǎn)互補(bǔ))連接起來,并通過5′端與接頭互補(bǔ)的半特異性引物擴(kuò)增得到大量DNA片段,從而形成指紋圖譜的分子標(biāo)記技術(shù)。AFLP指紋呈孟德爾式

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