葉綠素的提取、分離和測定

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1、實(shí)驗(yàn)四葉綠素的提取、分離和含量測定一、葉綠素的提取、分離（一）原理葉綠體中含有葉綠體色素（葉綠素a和b、胡蘿卜素及葉黃素）。這些色素均不溶于水，而溶于有機(jī)溶劑，故常用酒精或丙酮等提取。并可根據(jù)它們在不同有機(jī)溶劑中的溶解度不同以及在吸附劑上的吸附能力不同，將它們彼此分離開。（二）儀器和藥品研缽、吸管、小燒杯、試管、培養(yǎng)皿等95%酒精、石油醚碳酸鈣（三）步驟1、用天平稱取15g鮮葉，剪碎放入研缽中，加少量的CaCO3粉末及95%酒精5-10mL研成糊狀，再加95%酒精20mL，充分混勻以提取葉片勻漿中的色素，5-10分鐘后，過濾入三角燒瓶中加塞待用。2、取一張色層分析紙或定性濾紙代用

2、，剪成圓形，直徑應(yīng)略大于培養(yǎng)皿的直徑；將圓形濾紙平放在培養(yǎng)皿上，用滴管吸取葉綠素提取液，滴在濾紙的中心位置，稍干后，再重復(fù)操作幾次；然后取另一滴管吸取石油醚，慢慢地推動(dòng)葉綠素提取液，不久即可看到分離的各種色素的同心圓環(huán),由內(nèi)到外依次為：葉綠素a為藍(lán)綠色、葉綠素b為黃綠色、葉黃素呈鮮黃色、胡蘿卜素為橙黃色。二、葉綠素a和b含量的測定（一）原理葉綠素a、b在長波方面的最大吸收峰分別為為663nm和645nm。同時(shí)在該波長時(shí)葉綠素a、b比吸收系數(shù)k為已知，根據(jù)Lambert—Beer定律列出濃度C與光密度OD之間的關(guān)系式：OD663=82.04Ca+9.27CbOD645=16.75C

3、a+45.6CbCa、Cb為葉綠素a、b的濃度，單位mg/L解方程式得Ca=12.7OD663-2.69OD645Cb=22.9OD645-4.68OD663Ct=Ca+Cb=20.2D645+8.02D663(二）步驟1、稱取0.5g葉片，剪碎后置于玻璃勻漿器中加純丙酮5mL，研成勻漿，用80%丙酮10mL洗勻漿器，用80%丙酮定容到25mL，避光靜置5min。用移液管吸取上面的綠色清液1mL置于一大試管中，加入丙酮4ml稀釋，搖動(dòng)試管，作測定用。2、測量光密度值取上述提取液以80%丙酮作為空白對照，于663及645nm下讀取光密度值三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算結(jié)果代入公式求出各葉綠素的含

4、量（單位mg/L）最后計(jì)算時(shí)需考慮稀釋因子葉綠素a含量（mg/g鮮重）=CA*5*25*2/1000=0.25CA葉綠素b的含量（mg/g鮮重）=0.25CB葉綠素總含量（mg/g鮮重）=0.25CT