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1、第三章基因工程的載體和受體（ChapterIIIVectorsandHostsforGeneCloning）1一、用于基因克隆的載體質粒（plasmid）噬菌體或病毒DNA考斯質粒（cosmid）與噬菌粒人造染色體載體載體的功能及特征2攜帶外源DNA進入宿主細胞的工具能夠運載外源DNA片段（目的基因）進入受體細胞，具有自我復制能力，使外源DNA片段在受體細胞中得到擴增和表達，不被受體細胞的酶系統(tǒng)所破壞的一類DNA分子實質：用來攜帶目的基因片段進入受體細胞1.載體的概念（一）載體的功能及特征32.載體的功能（functionofvector）運送外源基因高效轉入受
2、體細胞為外源基因提供復制能力或整合能力為外源基因的擴增或表達提供必要的條件43.載體應具備的條件（characteristicsofvector）可轉移性：具有針對受體細胞的親緣性或親和性具有與受體細胞相適應的復制位點（ori，originofreplication）或整合位點具有較高的外源DNA的裝載能力多克隆位點（multiplecloningsite,MCS）：具有多種限制性內切酶的單一切點具有合適的篩選標記（selectionmarker）安全，不含對受體細胞有害的基因，不會任意轉入受體細胞以外的其他生物細胞中5質粒（plasmid）噬菌體或病毒DNA考
3、斯質粒（cosmid）與噬菌粒人造染色體載體4.載體的種類6（二）質粒（plasmid）1.質粒質粒是生物細胞內固有的、能獨立于染色體而自主復制，并被穩(wěn)定遺傳的一類核酸分子。質粒常見于原核細菌和真菌中。絕大多數的質粒是DNA型的。絕大多數質粒具有共價、封閉、環(huán)狀的分子結構，即cccDNA。質粒DNA的分子量范圍：1-300kb。功能：進行細胞間接合，并帶有一些基因，如產生毒素、抗藥性、固氮、產生酶類、降解功能等。7（1）質粒的自主復制性質粒能利用寄主細胞的DNA復制系統(tǒng)進行自主復制。質粒DNA上的復制子結構決定了質粒與寄主的對應關系。根據在每個細胞中的分子數（拷
4、貝數）多寡，質?？煞譃閮纱髲椭祁愋停簢谰o型復制控制的質粒：1-3拷貝stringentplasmid松弛型復制控制的質粒：10-60拷貝relaxedplasmid但細胞生長環(huán)境中，存在蛋白質合成抑制劑（氯霉素、壯觀霉素等）時，細胞的染色體DNA的復制受阻，但質粒仍可擴增，使其數量可達數千拷貝。2.質粒的基本特征8（2）質粒的不相容性（incompatibility）任何兩種含有相似復制子結構的不同質粒，不能同時存在于一個細胞中，這種現(xiàn)象稱為質粒的不相容性，不相容性的質以大腸桿菌的質粒為例：ColE1、pMB1擁有相似的復制子結構，彼此不相容pSC101、F、R
5、P4擁有相似的復制子結構，彼此不相容p15A及其衍生質粒擁有相似的復制子結構，彼此不相容粒組成不相容性群。9質粒不相容的分子機制兩種含有相似復制子結構的質粒，在復制時受同一種拷貝數控制系統(tǒng)的控制而產生競爭，致使兩種質粒的最終拷貝數不同，其中拷貝數多的質粒在以后的細胞分裂周期中更具優(yōu)勢，并逐步將另一質?！跋♂尅碧蕴?。兩種含有不同復制子結構的質粒，在復制時各受自己的拷貝數控制系統(tǒng)的調節(jié)，致使兩種質粒的最終拷貝數恒定，因此在經過若干復制周期和細胞分裂周期后仍能共處于同一細胞內。10（3）質粒的可轉移性革蘭氏陰性菌的質?？煞殖蓛纱箢悾航雍闲唾|粒能在天然條件下自發(fā)地從一個
6、細胞轉移到另一個細胞（接合作用），如F質粒。如Col、R質粒的一些成員。非接合型質粒不能在天然條件下獨立地發(fā)生接合作用值得注意的是，某些非接合型質粒（ColE1）在接合型質粒的存在和協(xié)助下，也能發(fā)生DNA轉移，這個過程由bom和mob基因決定。11（4）攜帶特殊的遺傳標記野生型的質粒DNA上往往攜帶一個或多個遺傳標記基因，這使得寄主生物產生正常生長非必需的附加性狀，包括：物質抗性抗生素、重金屬離子、毒性陰離子、有機物物質合成抗生素、細菌毒素、有機堿這些標記基因對DNA重組分子的篩選具有重要意義。123.幾種代表性質粒F–因子（fertilityfactor）：又
7、稱致育因子或性因子，62×106Dalton，94.5kb，相當于核染色體DNA2%的環(huán)狀雙鏈DNA，足以編碼94個中等大小多肽，其中1/3基因（tra區(qū)）與接合作用有關。存在于腸細菌屬、假單胞菌屬、嗜血桿菌、奈瑟氏球菌、鏈球菌等細菌中，決定性別。Figure.RepresentativeFERTILITYPLASMID.Afertilityplasmidcarriesthegenesforconjugationaswellasanumberofothergenes.Inthisfigurethefertilityplasmidalsocarriesantibi
8、oticresistan
