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《木糖還原酶基因的克隆及在釀酒酵母中的表達(dá).pdf》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、CloningofxylosereductasegenefromPichiastipitisandexpressioninSnCcharomyceScerevisiaebyMAHuimingAthesissubmittedinpartialsatisfactionoftheRequirementsforthedegreeofMasterofSciencelnBiochemistry&MolecularBiologylnCentralSouthUniversityofForestryandTechnology498ShaoshanSouthRoad，TianxinDistrictChang
2、shaHunan410004，P．R．CHINASupervisorProfessorChenJienanandHeGangApril，2011』惻愀磐必中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所呈交的論文是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下獨立進(jìn)行研究所取得的研究成果。除了文中特別加以標(biāo)注引用的內(nèi)容外，本論文不包含任何其他個人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫的成果作品，也不包含為獲得中南林業(yè)科技大學(xué)或其他教育機構(gòu)的學(xué)位或證書所使用過的材料。對本文的研究作出重要貢獻(xiàn)的個人和集體，均己在文中以明確方式表明。本人完全意識到本聲明的法律后果由本人承擔(dān)。)．r．作者簽名：知隧吲為ff年6月]日中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)位論
3、文版權(quán)使用授權(quán)書：麓輯¨啦琶秀澎毛／日作者簽名：倦嘲黝簽名：所釤々加11年名月]日2彥／／年勿月日摘要木糖是植物木質(zhì)纖維素的重要組成部分，木糖的發(fā)酵在生物質(zhì)轉(zhuǎn)化燃料乙醇中非常重要。傳統(tǒng)乙醇生產(chǎn)菌株釀酒酵母只能利用葡萄糖，而不能利用木糖發(fā)酵，但能發(fā)酵其異構(gòu)體木酮糖，可通過基因工程的方法將代謝木糖的關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)入釀酒酵母，對其進(jìn)行改造以獲得能利用木質(zhì)纖維素水解液中的多種組分又能穩(wěn)定高效產(chǎn)乙醇的基因工程菌。因此本研究主要目的是從發(fā)酵木糖的高效菌株樹干畢赤酵母中獲得發(fā)酵乙醇的第一個關(guān)鍵基因木糖還原酶基因，并將其轉(zhuǎn)化釀酒酵母，為后續(xù)發(fā)酵木糖產(chǎn)乙醇基因工程菌的構(gòu)建奠定基礎(chǔ)。本研究以樹干畢赤酵母(Pic
4、hiastipit&)CBS6054為基因供體菌，依據(jù)其在NCBI中公布的木糖還原酶基因序列設(shè)計特異引物，采用PCR的方法克隆到木糖還原酶基因序列，測序結(jié)果表明所得序列無堿基突變。將基因克隆到帶有強啟動子GPD的穿梭表達(dá)載體p424GPD中，并將載體p424GPD-xyll轉(zhuǎn)化大腸桿菌，通過超聲破碎方法提取大腸桿菌總蛋白，SDS．PAGE電泳分析總蛋白，測定木糖還原酶酶活，驗證載體構(gòu)建成功，表達(dá)載體的成功構(gòu)建為后續(xù)利用木糖發(fā)酵重組釀酒酵母的構(gòu)建奠定基礎(chǔ)。將構(gòu)建好的表達(dá)載體線性化處理后轉(zhuǎn)化釀酒酵母單倍體，通過營養(yǎng)缺陷型和PCR檢測進(jìn)行篩選。將篩選出的陽性重組子進(jìn)行培養(yǎng)，測定酶活，重組191
5、6和1917的酶活測定結(jié)果在0．1．O．3U／mg左右。將酶活最高的重組單倍體酵母1916—8與1917．1進(jìn)行結(jié)合，根據(jù)子囊孢子染色篩選二倍體，測定二倍體酶活，酶活結(jié)果在0．1U／mg左右，相比較單倍體釀酒酵母木糖還原酶基因的表達(dá)量，二倍體釀酒酵母酶活較低，沒有達(dá)到預(yù)理想結(jié)果。將表達(dá)載體導(dǎo)入酵母中表達(dá)，酵母經(jīng)過若干代繁殖后，質(zhì)粒容易丟失，所以構(gòu)建了酵母整合載體。將表達(dá)載體上的調(diào)控元件和木糖還原酶基因通過酶切酶連方法連接到整合載體上，其后通過將整合載體將木糖還原酶基因整合到酵母染色體上，使之成為酵母染色體DNA的一部分，增強其遺傳穩(wěn)定性，從而使其在釀酒酵母中高效穩(wěn)定的表達(dá)，為構(gòu)建高效穩(wěn)定
6、發(fā)酵木糖的酵母基因工程菌構(gòu)建奠定基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：樹干畢赤酵母；釀酒酵母；木糖還原酶；表達(dá)載體；整合載體ABSTRACTXyloseisoneofthemajorcomponentsincellulosicbiomass，andthefermentationofxyloseiSessentialforthebioconversionofbiomasstoethan01．ThecommonlyusedSaccharomycescerevisiaehasmanyadvantagesasanethanolproducer，suchasfastD—glucoseconsumption．However
7、,amajordrawbackisthatS．cerevisiaecannotutilizethepentosesugarxylose，onlyutilizingitsisomerxylulose．wecanattempttocloneandtransformthekeygeneencodingenzymesfortheconversionofxylosetoxyluloseinS．cerevisiaetogainthegeneen
