離子交換柱層析分離純化蔗糖酶

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1、實(shí)驗(yàn)二離子交換柱層析分離純化蔗糖酶一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵?、學(xué)習(xí)離子交換層析的基本原理；2、學(xué)習(xí)離子交換層析分離蛋白質(zhì)的基本方法和技術(shù)；3、學(xué)習(xí)蔗糖酶活性檢測的基本原理和方法。二、實(shí)驗(yàn)基本原理1、離子交換層析離子交換層析是常用的層析方法之一。它是在以離子交換劑為固定相，液體為流動相的系統(tǒng)中進(jìn)行的。離子交換劑與水溶液中離子或離子化合物的反應(yīng)主要以離子交換方式進(jìn)行，或者借助離子交換劑上電荷基團(tuán)對溶液中離子或離子化合物的吸附作用進(jìn)行。這些過程都是可逆的。在某一pH值的溶液中，不同的蛋白質(zhì)所帶的電荷存在差異，因而與離子交換劑的親和力就有區(qū)別。當(dāng)洗脫液的pH改變或者鹽的離子強(qiáng)度逐漸

2、提高時(shí)，使某一種蛋白質(zhì)的電荷被中和，與離子交換劑的親和力降低，不同的蛋白質(zhì)按所帶電荷的強(qiáng)弱逐一被洗脫下來，達(dá)到分離的目的。離子交換劑是由基質(zhì)、電荷基團(tuán)（或功能基團(tuán)）和反離子構(gòu)成?；|(zhì)電荷基團(tuán)反離子陽離子交換劑電荷基團(tuán)反離子陰離子交換劑電荷基團(tuán)反離子基質(zhì)基質(zhì)—＋—＋—＋溶液中的離子或離子化合物溶液中的離子或離子化合物可逆交換可逆交換＋—2、酶活力檢測(定性檢測）蔗糖酶（β-D-呋喃型果糖苷-果糖水解酶EC3.2.1.26），是一種水解酶。它能催化非還原性雙糖（蔗糖）的1,2－糖苷鍵裂解，將蔗糖水解為等量的葡萄糖和果糖（還原糖）。因此，每水解1mol蔗糖，就能生成2mol

3、還原糖。還原糖的測定有多種方法，如采用3.5－二硝基水楊酸法，其原理是3.5－二硝基水楊酸與還原糖共熱被還原成棕紅色的氨基化合物，在一定范圍內(nèi)還原糖的量和反應(yīng)液的顏色深度成正比。本實(shí)驗(yàn)在離子交換層析分離純化的過程中，對分離純化樣品采用3.5－二硝基水楊酸法來初步判定樣品中還原糖含量的多少，由此來確定并收集蔗糖酶純化樣品。三、實(shí)驗(yàn)材料與試劑1、實(shí)驗(yàn)材料蔗糖酶粗分離純化樣品Ⅲ2、實(shí)驗(yàn)試劑⑴DEAE-SepharoseFastFlow(弱堿性陰離子交換劑)；⑵20mmol/LTris-HClpH7.3緩沖液；⑶20mmol/LTris-HCl，（1mol/LNaCl）pH7

4、.3緩沖液(學(xué)生自配）；⑷0.2mol/L乙酸緩沖液，pH4.5；⑸5%蔗糖溶液；⑹3，5-二硝基水楊酸試劑甲液：溶解6.9g結(jié)晶酚于15.2ml10％NaOH溶液中，并用水稀釋至69ml,在此溶液中加6.9g亞硫酸氫鈉。乙液：稱取255克酒石酸鉀鈉加到300ml10%NaOH溶液中，再加入800ml1%3,5-二硝基水楊酸溶液.甲,乙二溶液相混合即得黃色試劑,貯于棕色瓶中備用,在室溫放置7-10天以后使用。四、實(shí)驗(yàn)器材與儀器1、高速冷凍離心機(jī)；2、層析柱（φ1.0×20㎝）(1支/組）；3、恒流泵（流速0.8～1ml/min）(10rpm)（1臺/組）；4、梯度混合

5、器(100ml梯度杯)（1套/組）；5、核酸蛋白檢測儀（靈敏度0.5A）（1臺/組）；6、記錄儀（紙速：0.5mm/min；靈敏度：50mV）（1臺/組）；7、部分收集器及收集試管（4ml/管）（1臺/組）；8、鐵架臺、夾子（固定層析柱用）（1套/組）；9、－20℃冰箱（保存樣品用）；10、微量移液槍200ul、1000ul；11、1.5ml離心管（留樣品Ⅲ和樣品Ⅳ用）；12、7ml離心管（留樣品Ⅳ用）；13、恒溫水?。?00℃）；14、試管、移液管、試管架等。五、實(shí)驗(yàn)操作方法和步驟1、離子交換劑準(zhǔn)備：DEAE—Sephadex，取適量DEAE—Sephadex，加入

6、0.5mol/LNaOH溶液，輕輕攪拌，浸泡0.5小時(shí)，用玻璃砂漏斗抽濾，并用去離子水洗至近中性，抽干后，放入小燒杯中，加50ml0.5mol/LHCl,攪勻，浸泡0.5小時(shí)，同上，用去離子水洗至近中性，（DEAE-SepharoseFastFlow，用后務(wù)必回收）。浸入20mmol/LTris-HClpH7.3緩沖液中平衡備用。DEAE-SepharoseFastFlow，（按說明書處理）2、樣品處理：將乙醇沉淀的蔗糖酶蛋白樣品充分溶解于15ml20mmol/LTris-HClpH7.3緩沖液；4℃15000r/min,離心10分鐘，收集樣品上清液（樣品Ⅲ）測量總體

7、積(ml數(shù)），留取1ml（樣品Ⅲ）用于蔗糖酶蛋白含量測定、蔗糖酶活力的測定以及用于SDS-PAGE分析；將其余樣品（樣品Ⅲ）作離子交換柱層析進(jìn)一步分離純化蔗糖酶(可先取50ul酶液做酶活力檢測）。3、純化檢測儀器連接：將梯度混合器(100ml梯度杯)，層析柱（φ1.0×20㎝），恒流泵(10rpm)（流速0.8～1ml/min），核酸蛋白檢測儀（靈敏度0.5A），記錄儀（紙速：0.5mm/min，50mV）、部分收集器（4～5ml/管/5min）等按下圖連接并設(shè)置好。211、50ml20mmol/LTris-HCl，pH7.3緩沖液2、50ml20m