基因工程常用受體細(xì)胞

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1、第三章：基因藥物體外表達(dá)的受體細(xì)胞第一節(jié)、宿主細(xì)胞選擇原則1、容易獲得較高濃度的細(xì)胞；2、安全，不致病；3、遺傳背景清楚，容易進(jìn)行DNA重組操作及遺傳改造；4、產(chǎn)物的產(chǎn)量高（表達(dá)水平和穩(wěn)定性）、生物活性高5、產(chǎn)物容易提取純化。6、容易進(jìn)行代謝調(diào)控；7、易培養(yǎng)（生長速度、營養(yǎng)需求、氧耗量等），培養(yǎng)成本低第二節(jié)、宿主細(xì)胞分類及特點(diǎn)分類：原核細(xì)胞（大腸桿菌、枯草芽胞桿菌、鏈霉菌等）真核細(xì)胞（酵母細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞）一、原核表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn)（一）優(yōu)點(diǎn)：1、結(jié)構(gòu)簡單，基因組成及功能相對(duì)清楚，易于遺傳操作及轉(zhuǎn)化2、

2、生理代謝途徑及表達(dá)調(diào)控機(jī)制相對(duì)清楚，便于表達(dá)調(diào)控3、生長迅速，要求條件低（大腸桿菌倍增時(shí)間為17分鐘），易于大規(guī)模培養(yǎng)。（二）缺點(diǎn)1、不能識(shí)別剪切內(nèi)含子，不能表達(dá)基因組DNA，只能表達(dá)cDNA；2、缺乏真核生物的蛋白質(zhì)加工修飾系統(tǒng)，不能進(jìn)行蛋白酶解、糖基化、磷酸化、乙?；?、硫酸化、酰胺化等修飾作用；蛋白酶解作用：從蛋白前體中切去一段氨基酸序列，從而獲得功能性分子糖基化意義：賦予蛋白獨(dú)特的結(jié)合性并增強(qiáng)穩(wěn)定性3、不具備真核生物的蛋白質(zhì)復(fù)性系統(tǒng)（如蛋白二硫鍵異構(gòu)酶），不能進(jìn)行真核蛋白的正確折疊；二、酵母（yeast）

3、表達(dá)體系特點(diǎn)酵母菌是最簡單的真核單細(xì)胞生物；是外源真核基因最理想的表達(dá)體系。（一）優(yōu)點(diǎn)：1、全基因組測序，基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理比較清楚，遺傳操作簡便2、具有原核生物無法比擬的蛋白翻譯后加工修飾系統(tǒng)。對(duì)表達(dá)的蛋白可進(jìn)行正確折疊和糖基化、磷酸化等修飾；3、安全：不含特異病毒、不產(chǎn)生毒素，美國FDA認(rèn)定為安全的4、繁殖迅速（倍增期約2小時(shí)），要求條件低，大規(guī)模發(fā)酵工藝簡單，成本低廉；5、能外分泌（二）缺點(diǎn)：1、生長相對(duì)細(xì)菌緩慢2、對(duì)有些生物活性蛋白仍無法表達(dá)或正確修飾，比如蛋白超糖基化超糖基化修飾作用酵母菌糖蛋白的N－糖

4、基外鏈的組成成分只有甘露糖，但其分支結(jié)構(gòu)極為復(fù)雜的的現(xiàn)象稱為超糖基化修飾作用。酵母菌高等真核生物O－寡聚多糖鏈甘露糖單體唾液酸基團(tuán)N－糖基外側(cè)鏈甘露糖甘露糖N－乙酰葡萄糖胺半乳糖果糖唾液酸等N-連接糖基化(N-linkedglycosylation)新合成蛋白進(jìn)行糖基化修飾的一種方式。糖通過與蛋白質(zhì)的天冬氨酸的自由NH2基連接，所以將這種糖基化稱為N-連接的糖基化。O-連接的糖基化（O-linkedglycosylation）高爾基體中進(jìn)行的另一種蛋白質(zhì)的糖基化，將糖鏈轉(zhuǎn)移到多肽鏈的絲氨酸、蘇氨酸或羥賴氨酸的羥

5、基的氧原子上。三、哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)特點(diǎn)是表達(dá)哺乳動(dòng)物基因（如人基因）的最好受體細(xì)胞。優(yōu)點(diǎn)：1、能識(shí)別和剪切內(nèi)含子并加工為成熟的mRNA，既可表達(dá)cDNA又可表達(dá)基因組DNA；2、表達(dá)產(chǎn)物具有正確地高級(jí)結(jié)構(gòu)和糖基化、磷酸化等修飾。3、表達(dá)產(chǎn)物可分泌到培養(yǎng)液中，純化容易。缺點(diǎn)：1、細(xì)胞生長慢，培養(yǎng)條件刻苛，大規(guī)模培養(yǎng)工藝復(fù)雜、費(fèi)用高2、培養(yǎng)液中產(chǎn)物濃度較小3、轉(zhuǎn)化細(xì)胞篩選麻煩主要基因工程表達(dá)體系比較表達(dá)體系產(chǎn)物產(chǎn)生部位培養(yǎng)方式提純產(chǎn)物活性潛在危性大腸桿菌多肽蛋白質(zhì)菌體內(nèi)容易一般對(duì)原核好不大融合蛋白質(zhì)部分高產(chǎn)對(duì)真核差

6、酵母多肽蛋白質(zhì)菌體內(nèi)容易菌體內(nèi)真核的接近不大糖基化蛋白外分泌可高產(chǎn)稍復(fù)雜天然產(chǎn)物哺乳動(dòng)物完整外分泌較難成本高簡單可達(dá)天然需注意糖基化蛋白可高產(chǎn)產(chǎn)物致癌第三節(jié)、常用原核表達(dá)細(xì)胞大腸桿菌枯草芽孢桿菌短小芽孢桿菌一、大腸桿菌表達(dá)體系（一）生物學(xué)特性革蘭氏陰性桿菌大小2～4um×0.4～0.1um；無芽孢；一般無莢膜(capsule)裂殖(Fission)分裂，37℃17分鐘繁殖一代。（二）特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：1、載體受體系統(tǒng)完備2、外源基因表達(dá)水平高，可達(dá)總蛋白5％～30％；3、下游技術(shù)成熟缺點(diǎn)：1、胞內(nèi)表達(dá)蛋白易形成無活性的

7、包涵體，需進(jìn)行復(fù)性操作；可溶性表達(dá)的胞內(nèi)真核蛋白易被細(xì)菌蛋白酶水解2、蛋白分泌機(jī)制不健全，外源真核基因很難實(shí)現(xiàn)分泌表達(dá)，且分泌產(chǎn)物大多只能分泌到細(xì)胞周質(zhì)（細(xì)胞質(zhì)與外膜之見的間隙）；少數(shù)分泌表達(dá)的蛋白表達(dá)效率比包含體形式低很多。3、胞內(nèi)表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)N端多余一個(gè)甲硫氨酸殘基（由起始密碼ATG編碼），影響活性或容易引起免疫反應(yīng)4、細(xì)胞壁含脂多糖（內(nèi)毒素），增加了分離純化難度包涵體細(xì)胞內(nèi)由生物大分子致密聚集形成的被膜包裹或無膜的水不溶顆粒狀物（相差顯微鏡或電子顯微鏡下可見）。組成：1、外源重組蛋白：50％以上2、宿主

8、蛋白：RNA聚合酶、核糖核蛋白體、外膜蛋白等3、質(zhì)粒編碼蛋白：如標(biāo)記基因產(chǎn)物4、非蛋白分子：DNA、RNA、脂多糖等蛋白特點(diǎn)：氨基酸序列組成正確，空間構(gòu)象往往錯(cuò)誤（三）在基因工程中的應(yīng)用擴(kuò)增外源DNA（雙鏈、單鏈）構(gòu)建基因文庫（DNA文庫、cDNA文庫）高效表達(dá)原核生物基因表達(dá)不需翻譯后加工、修飾的真核蛋白五、實(shí)驗(yàn)室常用的大腸桿菌用于接受質(zhì)粒：C600W3110HB101JM83JM1