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1、綠色熒光蛋白 在抗腫瘤藥物研究中的應(yīng)用概述1962年Shimomure等首先從維多利亞水母(AequoreaVictoria)中分離出了GFP(Green-FluorescentProtein)。1992年P(guān)rasher等克隆了GFP基因的cDNA，并分析了GFP的一級結(jié)構(gòu)。1994年Chalfie等首次在大腸桿菌細胞和線蟲中表達了GFP，開創(chuàng)了GFP應(yīng)用研究的先河。之后很快發(fā)現(xiàn)GFP能在多種異源細胞中表達，GFP在細胞學(xué)、分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)、病毒學(xué)等領(lǐng)域中迅速掀起了一股熱潮。GFP的發(fā)光特性GFP吸收的光譜,最大峰值為395nm(紫外),并有一個峰值為47
2、0nm的副峰(藍光);發(fā)射光譜最大峰值為509nm(綠光),并帶有峰值為540nm的側(cè)峰(Shouder)。GFP的光譜特性與熒光素異硫氰酸鹽(FITC)很相似,因此為熒光素FITC設(shè)計的熒光顯微鏡濾光片組合同樣適用于GFP觀察。盡管450～490nm(藍光)是GFP的副吸收峰,但由于長波能量低,細胞忍受能力強,因此更適合于活體檢測。GFP的性質(zhì)GFP熒光極其穩(wěn)定,在激發(fā)光照射下,GFP抗光漂白(Photobleaching)能力比熒光素(fluorescein)強，特別在450～490nm藍光波長下更穩(wěn)定。GFP需要在氧化狀態(tài)下產(chǎn)生熒光,強還原劑能使GF
3、P轉(zhuǎn)變?yōu)榉菬晒庑问?但一旦重新暴露在空氣或氧氣中,GFP熒光便立即得到恢復(fù)。而一些弱還原劑并不影響GFP熒光。中度氧化劑對GFP熒光影響也不大,如生物材料的固定、脫水劑戊二酸或甲醛等。GFP融合蛋白的熒光靈敏度遠比熒光素標(biāo)記的熒光抗體高,抗光漂白能力強,因此更適用于定量測定與分析。但因為GFP不是酶,熒光信號沒有酶學(xué)放大效果,因此GFP靈敏度可能低于某些酶類報告蛋白。由于GFP熒光是生物細胞的自主功能,熒光的產(chǎn)生不需要任何外源反應(yīng)底物,因此GFP作為一種廣泛應(yīng)用的活體報告蛋白,其作用是任何其它酶類報告蛋白無法比擬的。ComparisonofGFPandLu
4、ciferaseImagingMethodMinimumcellsimageableinvitroMinimumcellsimageableinvivoNeedforsubstrate?Needforanesthesia?MethodofvisualizationMulticolorimagingGFP11NoNoDirectImagingYesLuciferase3003000YesYesPhotoncounting(pseudo-color)NoGFP在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用GFP作為新型報告基因用于轉(zhuǎn)基因研究GFP融合蛋白用于研究蛋白質(zhì)定位、移動及相互作用
5、研究活細胞分子變化過程發(fā)育分子機理研究示蹤病原菌臨床檢驗在腫瘤研究中的應(yīng)用GFP在腫瘤研究中的應(yīng)用GFP在腫瘤發(fā)病機制研究中的應(yīng)用GFP在腫瘤發(fā)生發(fā)展研究中的應(yīng)用GFP在檢測腫瘤血管形成方面的應(yīng)用FP在抗腫瘤藥物篩選中的應(yīng)用GFP在腫瘤發(fā)病機制研究中的應(yīng)用GFP是一個分子量較小的蛋白,易與其他一些目的基因形成融合蛋白且不影響自身的目的基因產(chǎn)物的空間構(gòu)象和功能。GFP與目的基因融合,將目的基因標(biāo)記為綠色,即可定量分析目的基因的表達水平,顯示其在腫瘤細胞內(nèi)的表達位置和量的變化,為探討該基因在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用及其分子機制提供便利條件。在腫瘤的形成過程中,增
6、殖和凋亡是一對相互矛盾的統(tǒng)一體。若腫瘤細胞凋亡占優(yōu)勢,腫瘤組織將長期處于休眠狀態(tài)或自行消亡。腫瘤細胞的凋亡受凋亡相關(guān)基因調(diào)控。用GFP轉(zhuǎn)染腫瘤細胞凋亡相關(guān)基因,并與正常組織進行比較,若過表達,則大致可判斷此基因為抑制腫瘤細胞凋亡的基因;反之,為促進腫瘤細胞凋亡的基因。腫瘤細胞浸潤是腫瘤細胞粘連、酶降解、移動和基質(zhì)內(nèi)增殖等一系列過程的表現(xiàn),其根本原因在于腫瘤細胞內(nèi)某些基因表達異常。利用GFP的示蹤特性,研究腫瘤細胞內(nèi)某些基因異常表達與腫瘤細胞浸潤的關(guān)系,即可揭示腫瘤細胞浸潤的某些機制。GFP在腫瘤發(fā)生發(fā)展研究中的應(yīng)用研究腫瘤生長、浸潤和轉(zhuǎn)移的傳統(tǒng)方法是將載瘤
7、動物分階段處死,做成光學(xué)或免疫組化切片進行觀察,或采用CT、ECT、MRI、PET等影像儀器進行檢測。為了詳細了解腫瘤的生物學(xué)行為特征,即使使用大量的動物和昂貴的設(shè)備,也難以對腫瘤細胞的生長、瘤體形成過程進行連續(xù)、動態(tài)的觀察。曾有報道將標(biāo)記了熒光染料的腫瘤細胞經(jīng)血管注射到動物體內(nèi),研究轉(zhuǎn)移病灶形成過程,但由于標(biāo)記后腫瘤細胞的熒光信號很易衰減,加上腫瘤細胞分裂,通常2～3d后便難以顯示或跟蹤經(jīng)熒光標(biāo)記過的腫瘤細胞。為了克服上述缺陷,Yang等建立了一種在活體內(nèi)可連續(xù)、重復(fù)、動態(tài)觀察腫瘤細胞生長及瘤體形成過程的方法。Externalwhole-bodyimag
8、esoftheBxPC-3-GFPprimarytumorcomp
