綠色熒光蛋白.ppt

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1、綠色熒光蛋白(greenfluorescentprotein)基本介紹綠色螢光蛋白(greenfluorescentprotein)，簡稱GFP，這種蛋白質(zhì)最早是由下村修等人在1962年在一種學(xué)名Aequoreavictoria的水母中發(fā)現(xiàn)。其基因所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，在藍色波長范圍的光線激發(fā)下，會發(fā)出綠色螢光。這個發(fā)光的過程中還需要冷光蛋白質(zhì)Aequorin的幫助，且這個冷光蛋白質(zhì)與鈣離子(Ca2+)可產(chǎn)生交互作用。GFP性質(zhì)熒光極其穩(wěn)定。在激發(fā)光照射下，GFP抗光漂白(Photobleaching)能力比熒光素(fluorescein)強，特別在450～490nm藍光波長下更穩(wěn)定。需要在氧化狀

2、態(tài)下產(chǎn)生熒光。強還原劑能使GFP轉(zhuǎn)變?yōu)榉菬晒庑问?，但一旦重新暴露在空氣或氧氣中，GFP熒光便立即得到恢復(fù)。GFP融合蛋白的熒光靈敏度遠比熒光素標(biāo)記的熒光抗體高，抗光漂白能力強,適用于定量測定與分析。熒光的產(chǎn)生不需要任何外源反應(yīng)底物。故GFP作為一種廣泛應(yīng)用的活體報告蛋白，其作用是任何其它酶類報告蛋白無法比擬的。GFP在生物技術(shù)中的應(yīng)用分子標(biāo)記利用綠色熒光蛋白獨特的發(fā)光機制，可將GFP作為蛋白質(zhì)標(biāo)簽(protein-tagging)，即利用DNA重組技術(shù)，將目的基因與GFP基因構(gòu)成融合基因，轉(zhuǎn)染合適的細胞進行表達，然后借助熒光顯微鏡便可對標(biāo)記的蛋白質(zhì)進行細胞內(nèi)活體觀察。藥物篩選基于細胞的熒光分

3、析可分為三類：即根據(jù)熒光的密度變化、能量轉(zhuǎn)移或熒光探針的分布來研究目標(biāo)蛋白如受體、離子通道或酶的狀態(tài)的變化。熒光探針分布是利用信號傳導(dǎo)中信號分子的遷移功能，將一熒光蛋白與信號分子相偶聯(lián)，根據(jù)熒光蛋白的分布情況即可推斷信號分子的遷移狀況，并推斷該分子在遷移中的功能。由于GFP分子量小，在活細胞內(nèi)可溶且對細胞毒性較小，因而常用作熒光探針。融合抗體近二十年來，抗體生成技術(shù)有了飛速發(fā)展，已經(jīng)從細胞工程抗體發(fā)展到了基因工程抗體。單鏈抗體是研究得較多的一種小分子抗體。綠色熒光蛋白融合單鏈抗體后，因融合抗體具有與抗原結(jié)合及發(fā)射熒光兩種特性，故這一人工分子可用做免疫染色的檢測試劑，直接應(yīng)用于流式細胞儀和免疫

4、熒光的標(biāo)記及腫瘤的檢測等。生物傳感器綠色熒光蛋白由于其獨特的光信號傳導(dǎo)機制，以及在表達后易被周圍化學(xué)環(huán)境和蛋白之間的相互作用所影響的特性，因而極適于用做活細胞體內(nèi)的光學(xué)感受器。應(yīng)用前景轉(zhuǎn)染細胞的確定體內(nèi)基因表達的測定蛋白質(zhì)分子的定位和細胞間分子交流的動態(tài)監(jiān)測免疫分析核酸堿基探針分析分子間第二信使鈣離子和cAMP水平的指示亟待解決的問題熒光信號強度的非線性性質(zhì)使得定量非常困難多數(shù)生物具有微弱的自發(fā)熒光現(xiàn)象實驗中發(fā)現(xiàn)很難建成GFP穩(wěn)定細胞株,可能與GFP參與細胞凋亡過程有關(guān)THEEND