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1、核酸的分離與純化核酸的分離主要是指將核酸與蛋白質(zhì)、多糖、脂肪等生物大分子分開(kāi)。在分離核酸時(shí)，應(yīng)遵循兩個(gè)原則：一是保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性；二是盡量排除其它分子的污染，保證核酸樣品的純度。2021/8/92核酸分離與純化的過(guò)程一般都包括了材料的選擇、核酸的釋放、核酸與其它生物大分子的分離、核酸的純化與鑒定、核酸的濃縮、保存等幾個(gè)主要步驟。每一步驟又可由多種不同的方法單獨(dú)或聯(lián)合實(shí)現(xiàn)。2021/8/93一、材料的選擇臨床常見(jiàn)的標(biāo)本血液、組織及體外培養(yǎng)的細(xì)胞等都可作為提取核酸的原料，具體實(shí)驗(yàn)材料的選擇應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)的目的來(lái)確定。2021/8/94二、核酸的釋放（一）機(jī)械法包括低滲裂解、超聲
2、裂解、微波裂解、凍融裂解和顆粒破碎等物理裂解方法。這些方法用機(jī)械力使細(xì)胞破碎，但機(jī)械力也可引起高分子量線性分子的斷裂，因而不適用于染色體DNA的分離純化。2021/8/95（二）化學(xué)法在一定的pH環(huán)境下，加入表面活性劑或強(qiáng)離子劑使細(xì)胞裂解，蛋白質(zhì)和多糖沉淀，核酸被從細(xì)胞內(nèi)釋放出來(lái)。向緩沖液中加入一些金屬離子螯合劑抑制核酸酶的活性，保護(hù)核酸不被降解。2021/8/96（三）酶法通過(guò)加入溶菌酶或蛋白酶（如蛋白酶K）使細(xì)胞破裂，核酸釋放。蛋白酶還能降解與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)，促進(jìn)核酸的分離。溶菌酶能催化細(xì)菌細(xì)胞壁的蛋白多糖N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸殘基間的β-1,4鍵水解。蛋白酶K能
3、催化水解多種肽鍵，且在65℃及有EDTA、尿素和去垢劑如0.5%SDS或1%TritonX-100存在時(shí)仍保留有酶活性，對(duì)于高分子量核酸的提取有很大的優(yōu)勢(shì)。2021/8/97三、核酸的分離與純化（一）核酸分離純化的基本方法1.酚抽提法細(xì)胞裂解后離心分離含核酸的水相，加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇混合液，混勻后離心分離。蛋白質(zhì)被分配至有機(jī)相，核酸則被留于上層水相。在含核酸的水相中加入醋酸鉀或醋酸鈉，形成核酸鹽，核酸鹽可被一些有機(jī)溶劑沉淀，離心得到的核酸可以用70%乙醇洗滌以除去多余的鹽分，即可獲得一定純度的核酸。2021/8/9102.層析法包括吸附層析、親和層析、離子交換層析等。
4、因分離和純化同步進(jìn)行，并且有商品試劑盒供應(yīng)而被廣泛應(yīng)用于核酸的純化。在一定的離子環(huán)境下，核酸可被選擇性地吸附到硅土、硅膠或玻璃表面而與其他生物分子分離。2021/8/9113.密度梯度離心法雙鏈DNA、單鏈DNA、RNA和蛋白質(zhì)具有不同的密度，因而可經(jīng)密度梯度離心的方法形成不同密度的純樣品區(qū)帶，該法適用于大量核酸樣本的制備。2021/8/912氯化銫-溴化乙錠梯度平衡離心法是純化大量質(zhì)粒DNA的首選方法。氯化銫是核酸密度梯度離心的標(biāo)準(zhǔn)介質(zhì)，梯度液中的溴化乙錠與核酸結(jié)合，離心后形成的核酸區(qū)帶經(jīng)紫外燈照射產(chǎn)生熒光而被檢測(cè)。用注射針頭穿刺回收后，通過(guò)透析或乙醇沉淀除去氯化銫而獲得純化
5、的核酸。2021/8/913（二）基因組DNA的分離純化生物體組織細(xì)胞玻棒纏繞法酚抽提法基因組DNA粗品PFGE分離特定的DNA片段AGE分離PAGE分離乙醇沉淀洗滌基因組DNA純品精分離粗分離前處理離子交換層析純化有機(jī)溶劑抽提細(xì)胞裂解蛋白質(zhì)變性沉淀降解DNA釋放甲酰胺解聚法哺乳動(dòng)物基因組DNA分離純化的一般技術(shù)路線1.酚抽提法以含EDTA、SDS及無(wú)DNA酶的RNA酶裂解緩沖液裂解細(xì)胞，經(jīng)蛋白酶K處理后，用pH8.0的Tris飽和酚抽提DNA，重復(fù)抽提至一定純度后，根據(jù)不同需要行透析或沉淀處理，獲得所需的DNA樣品。2021/8/916DNA酚抽提法示意圖一、酚抽提法2021
6、/8/917主要試劑的作用：EDTA：二價(jià)金屬螯合劑，抑制核酸酶；降低細(xì)胞膜的穩(wěn)定性2021/8/918SDS的作用：溶解膜蛋白和脂肪，從而使細(xì)胞膜破裂；溶解核膜和核小體，使其解聚，將核酸釋放出來(lái)；對(duì)RNA、DNA酶有抑制作用；與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物，使蛋白質(zhì)變性。2021/8/919蛋白酶K：水解蛋白質(zhì)的作用，消化DNA酶和細(xì)胞中的蛋白質(zhì)。蛋白酶K與其他蛋白酶相比，它具有更強(qiáng)的水解能力，而且在SDS、EDTA存在時(shí)仍保持較高活性，可同時(shí)使用。2021/8/920酚可以使蛋白質(zhì)變性沉淀、抑制DNA酶活性。PH8.0的Tris溶液可以使得抽提出的DNA進(jìn)入水相，減少在蛋白質(zhì)層滯留。在
7、酚或酚-氯仿中加入少許的異戊醇，是可以減少實(shí)驗(yàn)中的氣泡的產(chǎn)生，而且利于分相，保持分相的穩(wěn)定性。2021/8/921為什么苯酚要重蒸飽和后才能用于DNA的分離？苯酚在空氣中經(jīng)常被氧化生成醌，它能夠產(chǎn)生自由基，如果直接用于DNA分離，會(huì)使磷酸二酯鍵斷裂，造成DNA降解。氧化苯酚需要經(jīng)過(guò)高溫重蒸以除去氧化物，并用Tris-Hcl飽和酚，并調(diào)節(jié)至中性。使用飽和酚可以減少酚吸收更多的DNA，降低DNA的損失率。2021/8/9222.甲酰胺解聚法細(xì)胞裂解與蛋白質(zhì)水解同酚抽提法相似，但不進(jìn)行酚的抽提，而
