間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)方法

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1、間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)方法1.間充質(zhì)干細(xì)胞MSC基本形態(tài)2.干細(xì)胞應(yīng)用與干細(xì)胞調(diào)控。3.間充質(zhì)干細(xì)胞MSC生長過程4.間充質(zhì)干細(xì)胞MSC培養(yǎng)的合適氣體環(huán)境5.細(xì)胞培養(yǎng)板的選擇6.如何選用細(xì)胞培養(yǎng)基7.如何維持培養(yǎng)液pH8.血清與干細(xì)胞的培養(yǎng)9.胎牛血清（FBS）是否需要滅活10.細(xì)胞的細(xì)菌、真菌污染及排除11.細(xì)胞培養(yǎng)污染的預(yù)防12.使用胰蛋白酶時加入EDTA的目的是什么13.膠原酶的種類和選型14.膠原酶VS胰酶15.干細(xì)胞的種類和表面標(biāo)記16.間質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)原理概述17.間質(zhì)干細(xì)胞成脂和成骨誘導(dǎo)分化18.干細(xì)胞

2、老化的表現(xiàn)和處理19.細(xì)胞傳代消化過程指導(dǎo)20.冷凍保護(hù)劑作用和選擇21.細(xì)胞凍存指導(dǎo)22.干細(xì)胞冷凍和復(fù)蘇23.移植細(xì)胞的基因修飾1．間充質(zhì)干細(xì)胞MSC基本形態(tài)體外培養(yǎng)細(xì)胞根據(jù)它們在培養(yǎng)器皿是否能貼附于支持物上生長特征，可分為貼附型生長細(xì)胞，常表現(xiàn)為成纖維型細(xì)胞和上皮細(xì)胞。懸浮型細(xì)胞在培養(yǎng)中懸浮生長。間充質(zhì)干細(xì)胞MSC基本形態(tài)：形態(tài)與成纖維細(xì)胞類似，細(xì)胞在支持物表面呈梭形或不規(guī)則三角形生長，細(xì)胞中央有卵圓形核，胞質(zhì)向外伸出2－3厘米個長短不同的突起?？煽吹郊?xì)胞成螺旋狀生長。?2．干細(xì)胞應(yīng)用與干細(xì)胞調(diào)控干細(xì)胞

3、的調(diào)控是指給出適當(dāng)?shù)囊蜃訔l件，對干細(xì)胞的增殖和分化進(jìn)行調(diào)控，使之向指定的方向發(fā)展。?2.1內(nèi)源性調(diào)控干細(xì)胞自身有許多調(diào)控因子可對外界信號起反應(yīng)從而調(diào)節(jié)其增殖和分化，包括調(diào)節(jié)細(xì)胞不對稱分裂的蛋白，控制基因表達(dá)的核因子等。另外，干細(xì)胞在終末分化之前所進(jìn)行的分裂次數(shù)也受到細(xì)胞內(nèi)調(diào)控因子的制約。（1）胞內(nèi)蛋白對干細(xì)胞分裂的調(diào)控干細(xì)胞分裂可能產(chǎn)生新的干細(xì)胞或分化的功能細(xì)胞。這種分化的不對稱是由于細(xì)胞本身成分的不均等分配和周圍環(huán)境的作用造成的。細(xì)胞的結(jié)構(gòu)蛋白，特別是細(xì)胞骨架成分對細(xì)胞的發(fā)育非常重要。如在果蠅卵巢中，調(diào)控干

4、細(xì)胞不對稱分裂的是一種稱為收縮體的細(xì)胞器，包含有許多調(diào)節(jié)蛋白，如膜收縮蛋白和細(xì)胞周期素A。收縮體與紡錘體的結(jié)合決定了干細(xì)胞分裂的部位，從而把維持干細(xì)胞性狀所必需的成分保留在子代干細(xì)胞中。（2）轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控在脊椎動物中，轉(zhuǎn)錄因子對干細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)非常重要。比如在胚胎干細(xì)胞的發(fā)生中，轉(zhuǎn)錄因子Oct4是必需的。Oct4是一種哺乳動物早期胚胎細(xì)胞表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，它誘導(dǎo)表達(dá)的靶基因產(chǎn)物是FGF-4等生長因子，能夠通過生長因子的旁分泌作用調(diào)節(jié)干細(xì)胞以及周圍滋養(yǎng)層的進(jìn)一步分化。Oct4缺失突變的胚胎只能發(fā)育到囊胚期，其內(nèi)

5、部細(xì)胞不能發(fā)育成內(nèi)層細(xì)胞團(tuán)。另外白血病抑制因子（LIF）對培養(yǎng)的小鼠ES細(xì)胞的自我更新有促進(jìn)作用，而對人的成體干細(xì)胞無作用，說明不同種屬間的轉(zhuǎn)錄調(diào)控是不完全一致的。又如Tcf/Lef轉(zhuǎn)錄因子家族對上皮干細(xì)胞的分化非常重要。Tcf/Lef是Wnt信號通路的中間介質(zhì)，當(dāng)與β-Catenin形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物后，促使角質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為多能狀態(tài)并分化為毛囊。?2.2外源性調(diào)控除內(nèi)源性調(diào)控外，干細(xì)胞的分化還可受到其周圍組織及細(xì)胞外基質(zhì)等外源性因素的影響。（1）分泌因子間質(zhì)細(xì)胞能夠分泌許多因子，維持干細(xì)胞的增殖，分化和存活。有兩

6、類因子在不同組織甚至不同種屬中都發(fā)揮重要作用，它們是TGFβ家族和Wnt信號通路。比如TGF家族中至少有兩個成員能夠調(diào)節(jié)神經(jīng)嵴干細(xì)胞的分化。最近研究發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)細(xì)胞衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子（GDNF）不僅能夠促進(jìn)多種神經(jīng)元的存活和分化，還對精原細(xì)胞的再生和分化有決定作用。GDNF缺失的小鼠表現(xiàn)為干細(xì)胞數(shù)量的減少，而GDNF的過度表達(dá)導(dǎo)致未分化的精原細(xì)胞的累積。Wnts的作用機(jī)制是通過阻止β-Catenin分解從而激活Tcf/Lef介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)干細(xì)胞的分化。比如在線蟲卵裂球的分裂中，鄰近細(xì)胞誘導(dǎo)的Wnt信號通路能夠

7、控制紡錘體的起始點(diǎn)和內(nèi)胚層的分化。（2）膜蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞間的相互作用有些信號是通過細(xì)胞-細(xì)胞的直接接觸起作用的。β-Catenin就是一種介導(dǎo)細(xì)胞粘附連接的結(jié)構(gòu)成分。除此之外，穿膜蛋白Notch及其配體Delta或Jagged也對干細(xì)胞分化有重要影響。在果蠅的感覺器官前體細(xì)胞，脊椎動物的胚胎及成年組織包括視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮、骨骼肌和血液系統(tǒng)中，Notch信號都起著非常重要的作用。當(dāng)Notch與其配體結(jié)合時，干細(xì)胞進(jìn)行非分化性增殖；當(dāng)Notch活性被抑制時，干細(xì)胞進(jìn)入分化程序，發(fā)育為功能細(xì)胞。（3）整合素（Inte

8、grin）與細(xì)胞外基質(zhì)整合素家族是介導(dǎo)干細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)粘附的最主要的分子。整合素與其配體的相互作用為干細(xì)胞的非分化增殖提供了適當(dāng)?shù)奈h(huán)境。比如當(dāng)β1整合素喪失功能時，上皮干細(xì)胞逃脫了微環(huán)境的制約，分化成角質(zhì)細(xì)胞。此外細(xì)胞外基質(zhì)通過調(diào)節(jié)β1整合素的表達(dá)和激活，從而影響干細(xì)胞的分布和分化方向。?2.3干細(xì)胞的可塑性越來越多的證據(jù)表明，當(dāng)成體干細(xì)胞被移植入受體中，它們表現(xiàn)出很強(qiáng)的可塑性。通常情況下，供體