六、克隆基因的表達(dá)

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1、GeneticEngineering1.基因工程概述2.基因工程的基礎(chǔ)知識(shí)與基本技術(shù)3.基因工程所需基本條件4.基因工程的操作過程5.目的基因的獲取6.克隆基因的表達(dá)7.轉(zhuǎn)基因生物技術(shù)6.克隆基因的表達(dá)外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)外源基因在真核細(xì)胞中的表達(dá)------酵母菌、昆蟲細(xì)胞、植物原生質(zhì)體、動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞遺傳信息從DNA到蛋白質(zhì)的傳遞過程——中心法則（centraldogma）?；虮磉_(dá)：克隆基因的表達(dá)：外源基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)。外源基因表達(dá)載體重組載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞在宿主細(xì)胞中表達(dá)出蛋白質(zhì)提取蛋白宿主細(xì)胞：原核細(xì)胞或

2、真核細(xì)胞。AdividingE.coli第一節(jié)外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)原核或噬菌體啟動(dòng)子MCSSD序列終止子識(shí)別原核細(xì)胞的啟動(dòng)子，催化所有的RNA合成。數(shù)個(gè)相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因與其調(diào)控區(qū)結(jié)合形成一個(gè)表達(dá)的協(xié)同單位。一、原核生物基因表達(dá)的特點(diǎn)2.以操縱子為單位1.只有一種RNA多聚酶有意義鏈5’反意義鏈3’轉(zhuǎn)錄mRNA5’3’翻譯蛋白質(zhì)NC5’3’3.轉(zhuǎn)錄和翻譯偶聯(lián)、連續(xù)進(jìn)行。4.不含內(nèi)含子，缺乏轉(zhuǎn)錄后的加工系統(tǒng)。5.調(diào)控主要在轉(zhuǎn)錄水平上。同核糖體16SRNA3’末端堿基互補(bǔ)的序列，叫Shine-Dalgarno（S-D）序列

3、︰5’AGGAGG3’。6.mRNA的核糖體結(jié)合位點(diǎn)Shine-Dalgarno（S-D）sequence:二、原核表達(dá)系統(tǒng)的注意事項(xiàng)外源基因不能帶有內(nèi)含子。2.不能直接用真核基因組DNA,必須用cDNA3.必須利用原核細(xì)胞的調(diào)控原件（啟動(dòng)子等）4.防止外源基因產(chǎn)物對(duì)宿主細(xì)胞的毒害。是DNA上的能與RNA聚合酶結(jié)合并能起始mRNA合成的序列。具序列特異性、方向性、位置特異性、種屬特異性。大腸桿菌的所有啟動(dòng)子中都有兩段一致順序（consensussequence）。三、原核生物基因表達(dá)的調(diào)控1.啟動(dòng)子-35Box和-10B

4、ox（1）啟動(dòng)子序列consensussequencesSextama框5’-TTGACA-3’5’-TATAAT-3’②-10box（PribnowBox）TTGACATATAAT轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)17bp5’核糖體結(jié)合位點(diǎn)RNA聚合酶?亞基的識(shí)別位點(diǎn)。①-35box原核啟動(dòng)子共有序列的功能（2）翻譯的起始位點(diǎn)①核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS）Shine-Dalgarno（SD）sequence：mRNA上與核糖體16sRNA結(jié)合的序列。ribosomebindingsiteSDmRNA5’—AGGAGGU——AUG——16SrRN

5、A3’UCCUCCAAUG（91%）GUG（8%）UUG（1%）位于SD序列下游。②起始密碼：SD序列距離AUG的距離，最佳7bp;SD序列與核糖體16SrRNA3’堿基的互補(bǔ)性；SD序列與AUG之間的堿基組成也很重要，AAAA、GGGG時(shí)效率最高SD序列影響翻譯效率：全酶是一個(gè)5聚體，含有兩個(gè)α小亞基，和2兩個(gè)大亞基（β和β′），一個(gè)σ亞基。2.RNA多聚酶大腸桿菌只有一種類型的RNA多聚酶轉(zhuǎn)錄tRNA，rRNA和mRNA。（1）結(jié)構(gòu)3.轉(zhuǎn)錄終止子內(nèi)終止子intrinsicterminator：E.coli中促使轉(zhuǎn)錄終

6、止的DNA位置有一段反向回文順序，其后緊接一串U，稱為內(nèi)終止子，或本征終止子，形成終止信號(hào)。不需要其他蛋白輔助因子參與在表達(dá)載體克隆位點(diǎn)的下游一般設(shè)計(jì)一段轉(zhuǎn)錄終止子。啟動(dòng)子操縱子S-D序列目的基因終止子由于莖環(huán)3’段緊接一串A/U的配對(duì)，穩(wěn)定性比較差，有利于轉(zhuǎn)錄物脫落而不利于轉(zhuǎn)錄延續(xù)。原因：反向回文順序被轉(zhuǎn)錄后，立即形成一個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)，使轉(zhuǎn)錄物與模板之間配對(duì)的堿基數(shù)降低，整個(gè)減弱了RNA與DNA的互作①莖環(huán)結(jié)構(gòu)②多聚A/U5-CCCACAGCCGCCAGTTCCGCTGGCGGCATTTTAACTTCTTTCT-33-GG

7、GTGTCGGCGGTCAAGGCGACCGCCGTAAAATTGAAGAAAGA-5(模板)轉(zhuǎn)錄↓5-CCCACAGCCGCCAGUUCCGCUGGCGGCAUUUU-OH-3(RNA)RNA折疊↓mRNA折疊UCCUGG—CA—UC—GC—GG—CC—GC—GG—CAACCCACUUUU—3DNARNA聚合酶脫落大腸桿菌偏愛UAAU。一般安置上全部的三個(gè)終止密碼防止核糖體跳躍（skipping）。Translationenhancer能夠顯著增強(qiáng)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的DNA序列，由多個(gè)元件組成，每一元件可與一種或多種轉(zhuǎn)錄調(diào)

8、控因子結(jié)合。具雙向性、特異性，其發(fā)揮功能與所處位置無關(guān)。4.翻譯終止密碼5.翻譯增強(qiáng)子①必須是一種強(qiáng)啟動(dòng)子能使外源基因的蛋白產(chǎn)量達(dá)到細(xì)胞總蛋白的10%-30%以上。②應(yīng)呈現(xiàn)低水平的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄便于表達(dá)毒性蛋白等。③應(yīng)是可誘導(dǎo)型的用溫度或化學(xué)試劑誘導(dǎo)。（1）最佳啟動(dòng)子必須具備的條件基因工程常用的原核啟動(dòng)子來自大腸桿菌的乳糖