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《第六章 克隆基因的表達》由會員上傳分享,免費在線閱讀,更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、第六章克隆基因的表達遺傳信息從DNA到蛋白質(zhì)的傳遞過程——中心法則(centraldogma)。(一)、基因表達:(二)克隆基因的表達:外源基因在宿主細胞中表達。外源基因表達載體重組載體導入宿主細胞在宿主細胞中表達出蛋白質(zhì)提取蛋白宿主細胞:原核細胞或真核細胞。一、外源基因表達機制P169(一)外源基因的起始轉(zhuǎn)錄啟動子和相關(guān)調(diào)控序列的作用增強子衰減子等(二)mRNA的延伸與穩(wěn)定性mRNA有效延伸、終止、穩(wěn)定性是表達關(guān)鍵。Prok.:終止子結(jié)構(gòu):(不)依賴ρ;避免提前終止:衰減子;RNase缺失受體菌Eur.:poly(A)摻入位點AAUAA;加工成熟mRNA(四)表達蛋白在細胞中的穩(wěn)定性構(gòu)
2、建融合蛋白表達系統(tǒng)、構(gòu)建分泌蛋白表達系統(tǒng)、構(gòu)建包涵體表達系統(tǒng)、選擇蛋白水解酶基因缺陷型的受體系統(tǒng).(三)外源基因mRNA的有效翻譯Prok.:SD序列,起始密碼子,SD與密碼子的距離等Euk.:5’cap,掃描序列GCC(A/G)CCAUGG,有效的ORF。密碼子使用頻率。(五)目的基因沉默(genesilencing)導入并整合到受體細胞核基因組上的外源基因,在當代或后代轉(zhuǎn)基因個體中表達活性受到抑制的現(xiàn)象。位置效應基因沉默:甲基化、異染色質(zhì)區(qū)等轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默:啟動子甲基化、基因異染色質(zhì)化轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默(PTGS)二、外源基因表達系統(tǒng)P161原核基因表達系統(tǒng):大腸桿菌基因表達系
3、統(tǒng)芽孢桿菌基因表達系統(tǒng)真核基因表達系統(tǒng):酵母基因表達系統(tǒng)昆蟲基因表達系統(tǒng)植物細胞基因表達系統(tǒng)動物細胞基因表達系統(tǒng)原核基因表達系統(tǒng)(大腸桿菌中表達系統(tǒng))(一)原核生物基因表達的特點P1531、原核生物只有一種RNA聚合酶,識別原核細胞的啟動子。表達調(diào)控主要在轉(zhuǎn)錄水平。5、mRNA5’端有SD序列,是mRNA結(jié)合到核糖體上必需的。2、基因的表達是以操縱子為單位進行協(xié)同表達。3、原核生物轉(zhuǎn)錄和翻譯是偶聯(lián)的。4、基因不含內(nèi)含子,真核生物mRNA在原核生物中表達不能成熟。(二)大腸桿菌作為表達外源基因受體菌的特征P1611、大腸桿菌表達外源基因的優(yōu)勢(1)遺傳背景清楚。全基因組測序,基因組結(jié)構(gòu)簡單
4、,便于基因操作和分析。(2)多數(shù)細胞內(nèi)有質(zhì)?;蚴删w,便于構(gòu)建相應表達載體,目標基因表達水平高。(3)代謝途徑和基因表達調(diào)控機制比較清楚(4)繁殖迅速、培養(yǎng)簡單、操作方便(5)被美國FDA批準為安全的基因工程受體生物2、大腸桿菌表達外源基因的劣勢(1)缺乏對真核生物蛋白質(zhì)的修飾加工系統(tǒng)(2)內(nèi)源性蛋白酶降解異源蛋白(三)外源基因在大腸桿菌中表達的原理啟動子終止子核糖體結(jié)合位點密碼子質(zhì)粒拷貝數(shù)表達載體的必要元件1、啟動子TTGACAsextamaboxTATAATTGTACA①必須是一種強啟動子能使外源基因的蛋白產(chǎn)量達到細胞總蛋白的10%-30%以上。②應是可誘導型的便于表達毒性蛋白等。③
5、應呈現(xiàn)低水平的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄用溫度或化學試劑誘導。(1)最佳啟動子必須具備的條件常用啟動子:乳糖啟動子Plac的可控性:乳糖啟動子均為抗葡萄糖代謝阻遏的突變型,即PlacUV5(2)乳糖啟動子lac(Lac表達系統(tǒng))P164CAP色氨酸啟動子Ptrp受色氨酸-阻遏蛋白復合物阻遏,轉(zhuǎn)錄呈基底狀態(tài)。(3)色氨酸啟動子trp(Trp表達系統(tǒng))IAA與Trp結(jié)構(gòu)相似,可以與阻遏蛋白結(jié)合。通過添加IAA可誘導Ptrp介導的目的基因的表達。cI857:調(diào)節(jié)基因cI:選擇一個溫度敏感性的突變基因cI857,克隆到載體上。42oC時阻遏蛋白失活,外源基因大量轉(zhuǎn)錄cI857PL外源基因30oC時阻遏PL,外源基
6、因不轉(zhuǎn)錄。(4)PL和PR啟動子(PL和PR表達系統(tǒng))從?噬菌體得到的一類啟動子,PL、PR是否轉(zhuǎn)錄與CI基因產(chǎn)物有關(guān),決定了噬菌體是進入溶源循環(huán)還是溶菌循環(huán)。2、終止子(terminator)P163RNA聚合酶滑過終止子繼續(xù)轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒上鄰近DNA序列,形成長短不一的mRNA混合物。常用:來自大腸桿菌rRNA操縱子上的rrnT1T2串聯(lián)終止子和T7噬菌體DNA上的TΦ強終止子保證載體不會轉(zhuǎn)錄非必須基因,不必浪費源料和能量、不干擾正常的表達。3、核糖體結(jié)合位點(RBS)大腸桿菌中,翻譯起始時,首先是核糖體小亞基(30S)識別和結(jié)合到mRNA5’端的翻譯起始部位,該順序稱為核糖體結(jié)合位點(r
7、ibosomebindingsite,RBS)四個特征要素:SD序列、翻譯起始密碼子、SD序列與翻譯起始密碼子之間的距離及堿基組成、基因編碼區(qū)5’端若干密碼子的堿基序列。SD序列:位于翻譯起始密碼子上游的5-13個核苷酸序列5’UAAGGAGG3’。5’-AGGAGGU-3’????S-D序列后面的4個堿基:如是A(U),翻譯效率最高;如是G(C),效率只有50%或25%。核糖體結(jié)合位點對外源基因表達的影響SD序列與起始密碼子之間的