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《實(shí)驗(yàn)八 親和層析分離純化蛋白質(zhì)(14)》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫(kù)。
1、實(shí)驗(yàn)八親和層析分離純化目標(biāo)蛋白實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆誈ST親和層析分離純化目標(biāo)蛋白的原理和實(shí)驗(yàn)方法（第一部分）掌握SDS-PAGE檢測(cè)目標(biāo)蛋白原理和方法（第二部分）第一部分GST親和層析分離純化目標(biāo)蛋白一、實(shí)驗(yàn)原理親和層析生物大分子與配體特異非共價(jià)可逆結(jié)合。酶-底物或底物類(lèi)似物抗體-抗原激素-受體外源凝集素-多糖、糖蛋白、細(xì)胞表面受體核酸-互補(bǔ)核苷酸序列（Oligo-dT）親和層析原理GST親合層析谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（GST，26kd，與谷胱甘肽GSH特異結(jié)合）GSH作為配體，共價(jià)結(jié)合在葡聚糖上，（Sepharose4B）GST融合目標(biāo)蛋白葡聚糖上的GSH與GST融合蛋白結(jié)合用還原型GSH洗
2、脫GST融合蛋白GSH-Sepharose4BGSH-Sepharose4B外源蛋白的表達(dá)和純化二、實(shí)驗(yàn)步驟（一）目標(biāo)蛋白誘導(dǎo)表達(dá)和菌體收集1．0.5mmol/LIPTG誘導(dǎo)大腸桿菌中的蛋白表達(dá)，28℃，200rpm培養(yǎng)3-6h。2．5000rpm離心5min，倒掉上清。3．沉淀加40ml水，5000rpm離心5min。（二）細(xì)胞破碎1．倒掉上清，加30mlPBS緩沖液懸浮菌體。2．破碎菌體，超聲波2min，停止1min。（菌液始終保持在冰浴中）3．重復(fù)8-10遍，直至菌液清澈。（三）離心1．每個(gè)小組分取1-2ml細(xì)胞破碎液，12000rpm，離心5min。2．分取50uL上清液
3、，4℃保存。3．其余的上清液準(zhǔn)備過(guò)GST柱子。（四）裝GST柱子1．清洗和裝好層析柱，封閉出口。2．加入2mLPBS。3．用滴管取0.5-1mlGST填料，加入柱子中。4．打開(kāi)柱子出口，使PBS緩慢流出。注意：始終保持柱內(nèi)的液面高于GST樹(shù)脂。（五）純化目的蛋白1．用5mlPBS緩沖液洗柱床，重復(fù)3遍。2．將混合蛋白質(zhì)溶液加到柱子中。3．用5mlPBS緩沖液洗柱子，重復(fù)3遍。4．加入1ml洗脫液。5．用離心管收集洗脫液，每管收集0.2ml。6．PBS緩沖液洗柱子3遍，關(guān)閉出口。7．用分光光度計(jì)測(cè)定每一管的吸光度值，記錄讀數(shù)，繪制洗脫曲線。8．將讀數(shù)最大的一管用于SDS-PAGE分
4、析。第二部分SDS-PAGE檢測(cè)目標(biāo)蛋白一、實(shí)驗(yàn)原理蛋白質(zhì)與SDS按1：1.4比例形成復(fù)合物，消除了蛋白質(zhì)間原有的電荷差異。蛋白質(zhì)的遷移速度只取決于分子大小。在15-200KD之間，遷移率和分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系：logMW=K-bm濃縮膠濃縮膠pH6.8，GlypI6.0，三類(lèi)離子在電場(chǎng)中的遷移速度：Cl->蛋白質(zhì)>Gly-。電泳時(shí)，Cl-快，Gly-慢，在快慢離子間形成了一個(gè)低離子濃度的高壓區(qū)，區(qū)內(nèi)的蛋白質(zhì)加速移動(dòng)。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)移到Cl-區(qū)時(shí)，高電壓消失，蛋白質(zhì)的移動(dòng)速度減慢，在快慢離子間被濃縮。二、實(shí)驗(yàn)步驟1．洗凈玻璃板，用蒸餾水沖洗干凈后吹干，安裝制膠器。2．根據(jù)下列配方制作
5、12%分離膠。12%分離膠試劑名稱12%分離膠蒸餾水2.5ml30%丙烯酰胺（29:1）3.0ml1.5MTris-HCl（pH8.8）2.0ml10%SDS75ul四甲基乙二銨（TEMED）10ul10%過(guò)硫酸銨（AP）75ul總體積7.5ml按上表中所列順序加試劑，加完AP后輕輕搖勻，迅速加入兩塊玻璃板間。在分離膠液面上緩慢滴加1mL蒸餾水，聚合15min，至分離膠與水之間出現(xiàn)一條清亮的分界線，倒掉水層，用濾紙條吸干殘余的水。試劑名稱5.0%蒸餾水1.7ml30%丙烯酰胺（29:1）430ul1MTris-HCl（pH6.8）310ul10%SDS25ul四甲基乙二銨（TEM
6、ED）10ul10%過(guò)硫酸銨（AP）25ul總體積2.5ml3．制作5.0%濃縮膠按照下表配好濃縮膠，輕輕混勻，灌膠2ml，插入梳子，聚合15min。4．把膠板放入電泳槽中，加入電泳緩沖液，拔掉梳子，電極緩沖液應(yīng)該完全沒(méi)過(guò)電極。5．每個(gè)點(diǎn)樣孔加30ul樣品，每板膠加10ulMarker。6．50V電泳20min，等蛋白進(jìn)入分離膠后，將電壓調(diào)節(jié)到80V，電泳2-3h。7．等到溴酚藍(lán)接近膠底部時(shí)，關(guān)閉電源。8．撬開(kāi)玻璃板，將凝膠放在塑料盒內(nèi)，加入染色液，染色30min。9．染色后的凝膠用蒸餾水漂洗，用脫色液脫色。（或用蒸餾水加熱脫色）pGEX-4T-3纖維素酶的純化非誘導(dǎo)誘導(dǎo)純化1純
7、化2Marker100KD75KD50KD32KD25KD15KD37℃，OD=0.8，0.5mmol/L，IPTG，28℃，200rpm，6hSDS-PAGE樣品制備1號(hào)樣，過(guò)親和層析柱前的蛋白質(zhì)溶液25uL，加5uL5X上樣緩沖液。2號(hào)樣，分離純化后的蛋白質(zhì)溶液25uL，加5uL5X上樣緩沖液3號(hào)樣，蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，老師準(zhǔn)備。標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量（marker）兔磷酸化酶B97400牛血清白蛋白66200兔肌動(dòng)蛋白43000牛碳酸酐酶31000胰蛋白酶抑制劑20100雞蛋清溶菌
