《層析分離純化技術(shù)》PPT課件

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1、層析分離純化技術(shù)內(nèi)容提要1、層析原理與操作2、蛋白質(zhì)純化策略生命科學(xué)與生物技術(shù)生物分離技術(shù)基因重組技術(shù)免疫檢測(cè)技術(shù)從基因組到蛋白質(zhì)從有限到無(wú)限離心沉淀電泳層析層析原理與操作層析的起源和原理起源----1906年，俄國(guó)植物學(xué)家Tsweet原理----利用物質(zhì)分配系數(shù)不同達(dá)到分離目的原理與操作Chromatography層析色譜什么是生物層析根據(jù)生物分子物理化學(xué)特性的不同而達(dá)到分離極性：polarity(solubility,volatility)HIC,RP離子特性：ioniccharacteristics(charge)IEX大小與形狀

2、：size/mass(diffusion,sedimentation)GF結(jié)構(gòu)特征與活性位點(diǎn)：shape(ligandbinding,affinity)AC這些特性的區(qū)別使不同分子在層析的固定相和流動(dòng)相的分配不同而達(dá)到分離原理與操作層析技術(shù)IonExchange(IEX)－離子交換電荷–可用于層析的任何步驟，根據(jù)純度要求，包括粗純捕獲、中間純化和最后的精細(xì)純化SizeExclusion(SEC)－分子篩（或凝膠過(guò)濾）分子大小–用于中間純化、脫鹽和緩沖液交換、最后精細(xì)純化Affinity(AC)－親和生物相互作用–用于復(fù)雜樣品的最早捕獲或

3、中間純化HydrophobicInteraction(HIC和RP)－疏水和反相疏水相互作用-用于中間純化，去除脂類和脂多糖CeramicHydroxyapatite(CHT)&CeramicFluoroapatite(CFT)－羥基磷灰石獨(dú)特分離機(jī)理，包含離子交換和金屬螯合等,可用于層析的任何步驟，根據(jù)純度要求，包括粗純捕獲、中間純化和最后的精細(xì)純化原理與操作液相層析最廣泛的蛋白質(zhì)分離純化方法條件溫和維持蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)與活性基于蛋白質(zhì)對(duì)固定相的不同保留達(dá)到分離蛋白質(zhì)溶于流動(dòng)相中，經(jīng)過(guò)裝填固定相的柱子分離原理與操作層析的5個(gè)操作步驟裝柱

4、并平衡上樣平衡洗脫再生上樣裝填有層析介質(zhì)的層析柱分離分離組分流出原理與操作層析圖原理與操作第一峰,外水體積,Vo,不與柱中填料相互作用直接從柱中流出。這是樣品中的未結(jié)合物質(zhì)VoVeVt蛋白質(zhì)含量(A280),由UV檢測(cè)器讀出，y軸基線洗脫峰，有些可以很好的分離，有些分得不是很好，有部分交叉有時(shí)這里也顯示梯度濃度等檢測(cè)值時(shí)間或體積，x軸DuoFLow軟件系統(tǒng)非常直觀，易學(xué)簡(jiǎn)單明快，4個(gè)步驟進(jìn)入操作：Browser?Setup?Protocol?Run觀察樣品情況,調(diào)節(jié)色普?qǐng)D和峰高度orGoDoSomethingElse!快速啟動(dòng)功能：2次

5、擊鍵進(jìn)入操作Browser?Run觀察樣品情況,調(diào)節(jié)色普?qǐng)D和峰高度orGoDoSomethingElse!DuoFLow軟件系統(tǒng)ManualScreenDuoFLow軟件系統(tǒng)Browser–EnterUserandMethodNameDuoFLow軟件系統(tǒng)Setup–selecthardwareDuoFLow軟件系統(tǒng)Protocol–entermethodDuoFLow軟件系統(tǒng)PostRunOptions-ActivityDuoFLow軟件系統(tǒng)PostRunOptions–PeakTaggingDuoFLow軟件系統(tǒng)PostRunOpt

6、ions–TRACECOMPARE層析圖比較單一柱子單一程序走不同樣品單一樣品和單一程序走不同柱子同一樣品和柱子走不同程序DuoFLow軟件系統(tǒng)DuoFLow軟件系統(tǒng)DuoFLow軟件系統(tǒng)純化平臺(tái)的硬件結(jié)構(gòu)——層析介質(zhì)與層析柱，原理與技術(shù)層析介質(zhì)離子交換層析介質(zhì)UnosphereQ，SMacroPrepHighQ,HighS,DEAE,CM親和層析ProfinityIMAC金屬螯合介質(zhì)ProfinityEpoxide環(huán)氧親和介質(zhì)Affi-GelProteinA,Affi-PrepProteinAAffi-Gel藍(lán)膠，DEAE藍(lán)膠，CM藍(lán)

7、膠Affi-Prep多粘菌素介質(zhì)Affi-Gel硼膠Affi-Gel配體固定化活化介質(zhì)凝膠過(guò)濾層析介質(zhì)Bio-GelP系列Bio-BeadsS-X介質(zhì)羥基磷灰石介質(zhì)（CHT）氟代羥基磷灰石介質(zhì)（CFT）疏水層析介質(zhì)Macro-PrepMethylHICMacro-Prept-ButylHICBio-BeadsSM-2吸附劑層析柱分析柱離子交換分析柱：UnoQ,SAminex分析柱——分析單糖、寡糖、有機(jī)酸、有機(jī)堿，以及肽和核酸有機(jī)小分子羥基磷灰石分析柱：Bio-ScaleCHT-I凝膠過(guò)濾分析柱：Bio-Sil,Bio-SilectHP

8、LC分析柱反相層析分析柱：Hi-PoreRP304,Hi-PoreRP318各種層析介質(zhì)的Cartridges——用于條件摸索MacroPrepCHTHICBio-ScaleMiniCartridgesUN