總rna的分離純化及逆轉錄實驗

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1、人外周血單個核細胞總RNA的分離純化及其逆轉錄外周血單個核細胞分離原理人外周血單個核細胞（peripheralbloodmononuclearcell，PBMC）包括淋巴細胞和單核細胞。單核細胞的體積、形態(tài)和比重與外周血其他細胞不同，因此利用一種介于1.075-1.090之間的聚蔗糖-泛影葡胺（ficoll-hypaque）分離液作密度梯度離心，離心后不同比重的血細胞在分離液中呈梯度分布，從而分離出PBMC.實驗步驟人外周血單個核細胞的分離：1.吸取2ml淋巴細胞分離液加入玻璃試管；2.取抗凝血1ml，用1ml生理鹽水稀釋混勻，然后沿管壁緩慢加入淋

2、巴分離液（上層為抗凝血，下層為淋巴細胞分離液）；3.2500rpm，離心15min(沉降系數(shù)不同，而分離出單核細胞)；4.吸取出最上層血漿（棄用），再吸取單核細胞層至一新的試管中，加生理鹽水至管口1cm處，混勻后離心，2500rpm,5min；5.去上清（棄用），加生理鹽水0.5ml吹打混勻后，轉入1.5mlEP管中，2500rpm,5min；6.去上清（棄用），留細胞沉淀于Ep管中于下一步總RNA的提取。RNA提取原理真核生物，絕大多數(shù)基因含有內(nèi)含子，因此不易直接由基因組克隆目的基因，提取RNA并逆轉錄形成cDNA是獲得真核生物基因的主要手段RN

3、A極易降解，因其RNA酶分布廣、活性強、且難以失活，痕量的RNA酶就能夠造成嚴重的RNA降解，實驗中采用多種措施抑制RNA酶的活性，減少RNA的降解。酸性酚法抽提RNA其原理是，苯酚在酸性條件下既可溶解DNA，又是蛋白變性劑，聯(lián)用氯仿可使細胞裂解以及蛋白質與RNA分離，最后利用異丙醇沉淀核酸，獲的純化的總RNA。抑制RNA酶活性的試劑1.焦磷酸二乙酯（DEPC)，一種強烈的烷化劑，能夠和RNA酶的活性基團組氨酸的咪唑環(huán)反應而以抑制外源RNA酶。2.異硫氰酸胍，一種強蛋白變性劑，可使包括RNA酶在內(nèi)的所有酶活性喪失　抑制外源性RNA酶活性。單核細胞中

4、總RNA的提取1.在上述Ep管中加入500μl變性液（TRIzol:苯酚+異硫氰酸胍）、懸浮細胞，加100μl氯仿，強烈震蕩或置漩渦混合器上混勻，冰浴5min.2.4℃,12000rpm,離心20min。吸取上層無色水相轉入另一1.5mlEP管中，加入等體積異丙醇，室溫放置10min。3.4℃12000rpm,離心20min,去上清，加入500μl70%乙醇（不吹打）4℃12000rpm,離心15min，去上清，烘干。4.加10μlDEPC(焦磷酸二乙酯）水溶解RNA。基因組DNA水相有機相RNA氯仿純化pH5.7離心加入裂解液(TRNzol-A+

5、)注意事項預防RNase污染1人的唾液中含有大量RNase，皮膚中含有RNase和細菌，而霉菌有可能成為RNase來源。2要使用滅菌的RNA專用的塑料制品，避免交叉污染。3RNA在TRIzol中不會被RNase污染，我們要注意后續(xù)的實驗中要使用不含有RNase的塑料制品和玻璃器皿。逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）原理提取組織或細胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo(dT)或隨機引物，利用逆轉錄酶特異性地反轉錄成cDNA，再以cDNA為模板進行PCR擴增，而獲得目的基因。轉錄產(chǎn)物具有連續(xù)的氨基酸編碼區(qū)，不需要進行剪接，可在原核

6、細胞中表達。完整的逆轉錄反應體系除需要逆轉錄酶、適當?shù)姆磻彌_液。RNA模板、逆轉錄酶及四種脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP）外，還需加入RNase抑制劑。本實驗利用人外周單個核細胞中RNA逆轉錄成cDNA，然后再以此cDNA為模板，利用特異性引物，通過PCR選擇性擴增細胞因子的cDNA序列。逆轉錄反應體系：MgSO42ml2*bcastBuffer5mldNTP0.5mlRNasin0.25mlRandomprimer0.5ml樣品總RNA1.25ml總體積10mlRT-PCR擴增細胞因子mRNA反應條件：65oc1min30oc5min30oc-6

7、5oc15min--30min(勻速升溫）98oc5min5oc5min反應體系：10*Buffer2mlMg2+1.5mldNTP2mlcDNA5mlTaq0.2mlprimer2mlddH2O17.3ml總體積30ml反應條件：94℃5min94℃45s56℃30s72℃30s72℃5min4℃保存×30cPCR擴增結果與分析PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳鑒定具體實驗結果分析