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《chap05 RNA的分離純化》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、第5章RNA的分離純化5.1RNA的分離純化原理5.2特殊類型的RNA的分離純化本章主要內(nèi)容5.1總RNA的分離純化原理一個典型的哺乳動物細胞中含有約10-5μgRNA，其中80％一85％是rRNA，10％～15％為tRNA，mRNA占1～5％，其他的各類RNA不到1％。這些高豐度的rRNA和tRNA的大小和序列確定，可通過凝膠電泳、密度梯度離心、陰離子交換層析和高壓液相層析(HPLC)等進行。而不同的mRNA之間在大小和序列方面相差很大，長度從幾百堿基到幾千堿基不等。但大多數(shù)真核mRNA3'端帶有足夠長的多聚腺苷酸殘基，使其可通過與
2、掛有oligod(T)的纖維素親和而純化。與DNA的提取類似，RNA的提取一般也要經(jīng)過細胞組織破碎，除去蛋白質(zhì)和DNA以及其他雜質(zhì)，最后得到RNA。需要注意的是由于分解RNA的RNA酶活性很強而且分布極為廣泛，以及RNA本身的不穩(wěn)定性，所以需要特別注意防止RNA被降解。在提取過程的第一階段細胞的RNA酶應盡快滅活。一旦內(nèi)源的RNA酶被破壞，RNA受損的可能就大大降低，而純化的過程就可以按合適的速度進行。RNA的提取方法一般有酚法，去污劑法和鹽酸胍法等，這些方法都可以用來提取具有生物活性的RNA。此外，工業(yè)上還常用稀堿法和濃鹽法提取酵母
3、RNA。用稀堿法和濃鹽法所提取的核酸均為變性的RNA，主要用作制備核苷酸的原料，工藝比較簡單。稀堿法使用1％NaOH使酵母細胞裂解，使核酸釋放出來。然后用鹽酸中和，除去菌體，水溶液中的RNA用酸調(diào)pH2.5，即沉淀得RNA粗品。濃鹽法是在10％NaCl溶液90℃提取3－4小時，然后提取液經(jīng)離心后以乙醇沉淀RNA。可以使RNase失活的一些試劑硫氰酸胍、鹽酸胍、異硫氰酸胍、亞硫氫胍、苯酚、巰基乙醇、n-月桂肌氨酸、氯仿、RNA酶的蛋白質(zhì)抑制劑、氧釩核糖核苷復合物、硅藻土(Macaloid)等。這些試劑有的是在細胞破碎之后就要加入的，但是
4、有的是要在分離純化的后期才加入的。幾種提取具有生物活性RNA的方法(1)胍鹽法(2)去垢劑法(3)苯酚法(1)胍鹽法用鹽酸胍提取分離RNA是20世紀50年代提出的，早期由于各實驗使用鹽酸胍的濃度不同，所得到RNA分子量大小差別較大。后來證明4M鹽酸胍不僅可以使蛋白質(zhì)變性而與核酸分離，而且還有效抑制RNase。但2M濃度的鹽酸胍則不能很好抑制RNase，所得RNA分子量較低。但如使用其他抑制劑配合2M鹽酸胍使用，則也可獲得較高分子量的RNA。鹽酸胍法也可用于DNA的提取，但具體例子不多。總的來說，鹽酸胍是提取分離RNA的一種方法，但不如
5、酚法和去污劑法效果好，故應用不廣。硫氰酸胍用硫氰酸胍提取RNA的方法是首先在1977年由Ullrich等提出，而在1978、1979年由Han和Chirgwin等正式發(fā)表的文章得到詳述。由于Han的方法中要用連續(xù)少量的5M硫氰酸胍溶解RNA，較為繁瑣。而在Chirgwin的方法中，培養(yǎng)好的組織或細胞用4M硫氰酸胍溶解，將所得的勻漿鋪在氯化銫濃溶液上。由于RNA在氯化銫中的浮密度(1.8g/ml)比其他細胞成分的浮力密度大得多，在超速離心過程中rRNA和mRNA將沉到管底。蛋白將保留在胍基鹽裂解液中而DNA懸浮在氯化銫上層液體中。由于C
6、hirgwin的方法能夠較易得到回收率和質(zhì)量都很高的RNA，因此成為20世紀80年代早期提取高相對分子質(zhì)量RNA的常規(guī)方法。然而該方法有一個缺陷，即不適合從很多不同的培養(yǎng)細胞中分離RNA。為此后來發(fā)展出一步法。在一步法中，硫氰酸胍用酚、氯仿抽提。該方法不需要超速離心，因而可使許多樣品同時進行操作并且提高速度、降低成本，而且在得到最后產(chǎn)物或純RNA的過程中不會有浪費。有兩種情況是一步法所不適用的。一種情況是該方法不適合從含有豐富甘油三酯的脂肪組織中提取RNA。另一種情況是提取RNA的胍基鹽被細胞內(nèi)的多糖和蛋白多糖所不同程度的污染。有報道
7、說這種污染阻止了乙醇共沉淀后RNA的溶解，影響RT-PCR的結(jié)果，而且在RNA印跡過程中與膜結(jié)合。所以，如果出現(xiàn)了多糖和蛋白多糖污染的問題，應該使用其他的方法和改變RNA沉淀條件。(2)去垢劑法去垢劑不僅廣泛應用于DNA的提取，也普遍應用于提取各種RNA。其中使用最多的是十二烷基硫酸鈉(SDS)，使用濃度為0.5－2％，單獨使用此法提取動物組織的RNA和植物病毒的RNA曾取得一定成功，但不能將蛋白質(zhì)完全除去。近年來多與酚法、氯仿法、超離心法結(jié)合提取不同材料的tRNA、rRNA、mRNA獲得十分良好的效果。其中尤以去污劑/苯酚法最受歡迎
8、。(3)苯酚法苯酚法用于提純RNA先于DNA，現(xiàn)仍是分離提取RNA最好的方法，此法可以單獨使用或與其他方法結(jié)合使用，廣泛用于各種RNA的提取。根據(jù)其使用條件及與其他方法結(jié)合情況可分為冷酚法、熱酚法，皂土-酚法、去垢劑-酚
