GBT19200-2003 豬水泡病診斷技術(shù).pdf

《GBT19200-2003 豬水泡病診斷技術(shù).pdf》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。

1、ICs11.220B41中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T19200-2003豬水泡病診斷技術(shù)Diagnostictechniquesforswinevesiculardisease2003-06-17發(fā)布2003-12-01實(shí)施中華人民共和國發(fā)布國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.www.bzxzk.com.GB/T19200-2003月組舀豬水泡病(SwineVesicularDisease，簡稱SVD)是豬的一種烈性傳染病，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織[WorldOrganizationforAnimalHealth(英),OfficeInternationaldesEpizoo

2、ties(法)，OIE]列為A類疾病，我國將其列為一類動(dòng)物疫病。本病主要在豬的蹄踵、蹄冠、唇、舌、鼻及乳頭部引起水泡，臨床癥狀與豬口蹄疫(FootandMouthDisease，簡稱FMD)相似。本標(biāo)準(zhǔn)提出的實(shí)驗(yàn)室方法主要是以世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)K哺乳動(dòng)物、禽、蜜蜂A和B類疾病診斷試驗(yàn)和疫苗標(biāo)準(zhǔn)手冊(cè)》為依據(jù)，并結(jié)合我國實(shí)際情況制定，其中“豬水泡病反向間接血凝試驗(yàn)”是我國建立的方法。本標(biāo)準(zhǔn)的附錄A、附錄B、附錄C、附錄D、附錄E均為規(guī)范性附錄。附錄F為資料性附錄。本標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國農(nóng)業(yè)部提出。本標(biāo)準(zhǔn)由全國動(dòng)物檢疫標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位:中國

3、農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人:張永光、牟克斌、王永錄、劉西蘭、方玉珍。.www.bzxzk.com.GB/T19200-2003豬水泡病診斷技術(shù)范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了豬水泡病病毒分離及鑒定，反向間接血凝試驗(yàn)(RIHA)、瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散試驗(yàn)(AGID)和病毒中和試驗(yàn)(VN)的技術(shù)要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于豬水泡病的診斷。反向間接血凝試驗(yàn)和瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散試驗(yàn)適用于大批樣品篩選試驗(yàn)，包括產(chǎn)地檢疫、疫情監(jiān)測、流行病學(xué)調(diào)查和無本病健康豬群的建立;病毒中和試驗(yàn)(VN)適用于診斷和進(jìn)出口豬檢疫及抗體水平的評(píng)估。2病毒分離及鑒定2.1材料準(zhǔn)備2.1.1滅菌注射器，研缽。2.

4、1.2pH7.6,0.05mol/L的磷酸緩沖液(PB),pH7.6,50%的丙三醉磷酸緩沖液(GPB),pH7.2,。.11mol/L的磷酸緩沖液(PB)，配制方法見附錄A,2.1.3仔豬腎傳代細(xì)胞(IB-RS-2)，乳鼠。2.1.4細(xì)胞培養(yǎng)液，見附錄B,2.2樣品的采集及處理2.2.1水泡液:將水泡表面用75%酒精棉球消毒，用注射器抽取水泡液，直接放人滅菌小瓶中，加蓋封口，避光送至實(shí)驗(yàn)室，不做處理直接用于檢測。2.2.2水泡皮:采集鼻鏡、蹄部新鮮水泡皮，采集量為0.5g以上，放人預(yù)先加有pH7.6,50%的GPB的滅菌瓶中，加蓋封口，送至實(shí)驗(yàn)室。2.3細(xì)胞分

5、離2.3.1新鮮水泡液不做任何處理，可直接使用。當(dāng)IB-RS-2長滿單層細(xì)胞后，棄去培養(yǎng)液，加人水泡液，以能淹沒細(xì)胞單層為宜，于370C感作30min，然后補(bǔ)加4倍于水泡液的細(xì)胞培養(yǎng)液，置370C培養(yǎng)。每天在倒置顯微鏡下觀察2次，48h終判，若細(xì)胞培養(yǎng)液對(duì)照孔成立，分離病毒的細(xì)胞孔細(xì)胞出現(xiàn)變圓乃至脫落，則視為細(xì)胞病變(CPE)判為陽性，若48h不出現(xiàn)CPE，則應(yīng)凍融2次，再育傳3代，不出現(xiàn)CPE，判為陰性，出現(xiàn)CPE，則需做進(jìn)一步鑒定。2.3.2水泡皮的分離，將水泡皮用pH7.2,0.11mol/LPB洗2次一3次，用滅菌濾紙吸去水分，稱其質(zhì)量后置于加少量石英砂

6、或玻璃砂的研缽中，按質(zhì)量體積比(1:2)一(1:5)加人pH7.2,0.11mol/I.PB研磨，制成懸液，室溫浸毒Ih或4'C12h，以3000r/min離心20min-30min，取上清液用于病毒分離。2.4乳鼠分離2.4.1乳鼠為2-3日齡小鼠，每份材料接種4只小鼠，每只頂背部皮下接種。.1mI,-O.2mL，在母鼠哺乳下觀察5天。2.4.2若5天內(nèi)出現(xiàn)神經(jīng)癥狀乃至死亡，剝皮去頭及內(nèi)臟，將肌肉及骨胳一起稱量，按質(zhì)量體積比加9倍的細(xì)胞培養(yǎng)液，加玻璃砂研磨制成懸液，置40C浸毒過夜.以1000r/min離心10min，取上清液用于進(jìn)一步鑒定。2.5反向間接血凝

7、試驗(yàn)(RIHA)鑒定分離物.www.bzxzk.com.GB/T19200-20032.5.1材料準(zhǔn)備2.5.1.196孔V型聚乙烯血凝滴定板(110度)，微量振蕩器或微型混合器，0.025m1_0.05mI_稀釋用滴管、乳膠吸頭或25pL,50川一移液加樣器2.5.1.2稀釋液I、稀釋液l，配制方法見附錄C2.5.1.3標(biāo)準(zhǔn)抗原、標(biāo)準(zhǔn)陽性血清2.5.1.4敏化紅細(xì)胞診斷液，效價(jià)滴定見附錄Do2.5.2操作方法2.5.2.1使用標(biāo)準(zhǔn)抗原進(jìn)行豬水泡病與口蹄疫A,O,C,Asia-I型鑒別診斷。2.5.2.1.，被檢樣品的稀釋:把8支試管排列于試管架上，自第1管開始

8、，每管加。.5ml稀釋液