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《GBT 19200-2003 豬水泡病診斷技術》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、ICs11.220B41中華人民共和國國家標準GB/T19200-2003豬水泡病診斷技術Diagnostictechniquesforswinevesiculardisease2003-06-17發(fā)布2003-12-01實施中華人民共和國發(fā)布國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局GB/T19200-2003月組舀豬水泡病(SwineVesicularDisease，簡稱SVD)是豬的一種烈性傳染病，被世界動物衛(wèi)生組織[WorldOrganizationforAnimalHealth(英),OfficeInternationaldesEpizooties(法
2、)，OIE]列為A類疾病，我國將其列為一類動物疫病。本病主要在豬的蹄踵、蹄冠、唇、舌、鼻及乳頭部引起水泡，臨床癥狀與豬口蹄疫(FootandMouthDisease，簡稱FMD)相似。本標準提出的實驗室方法主要是以世界動物衛(wèi)生組織(OIE)K哺乳動物、禽、蜜蜂A和B類疾病診斷試驗和疫苗標準手冊》為依據，并結合我國實際情況制定，其中“豬水泡病反向間接血凝試驗”是我國建立的方法。本標準的附錄A、附錄B、附錄C、附錄D、附錄E均為規(guī)范性附錄。附錄F為資料性附錄。本標準由中華人民共和國農業(yè)部提出。本標準由全國動物檢疫標準化技術委員會歸口。本標準起草單位
3、:中國農業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所。本標準主要起草人:張永光、牟克斌、王永錄、劉西蘭、方玉珍。GB/T19200-2003豬水泡病診斷技術范圍本標準規(guī)定了豬水泡病病毒分離及鑒定，反向間接血凝試驗(RIHA)、瓊脂凝膠免疫擴散試驗(AGID)和病毒中和試驗(VN)的技術要求。本標準適用于豬水泡病的診斷。反向間接血凝試驗和瓊脂凝膠免疫擴散試驗適用于大批樣品篩選試驗，包括產地檢疫、疫情監(jiān)測、流行病學調查和無本病健康豬群的建立;病毒中和試驗(VN)適用于診斷和進出口豬檢疫及抗體水平的評估。2病毒分離及鑒定2.1材料準備2.1.1滅菌注射器，研缽。2.1.2
4、pH7.6,0.05mol/L的磷酸緩沖液(PB),pH7.6,50%的丙三醉磷酸緩沖液(GPB),pH7.2,。.11mol/L的磷酸緩沖液(PB)，配制方法見附錄A,2.1.3仔豬腎傳代細胞(IB-RS-2)，乳鼠。2.1.4細胞培養(yǎng)液，見附錄B,2.2樣品的采集及處理2.2.1水泡液:將水泡表面用75%酒精棉球消毒，用注射器抽取水泡液，直接放人滅菌小瓶中，加蓋封口，避光送至實驗室，不做處理直接用于檢測。2.2.2水泡皮:采集鼻鏡、蹄部新鮮水泡皮，采集量為0.5g以上，放人預先加有pH7.6,50%的GPB的滅菌瓶中，加蓋封口，送至實驗室。
5、2.3細胞分離2.3.1新鮮水泡液不做任何處理，可直接使用。當IB-RS-2長滿單層細胞后，棄去培養(yǎng)液，加人水泡液，以能淹沒細胞單層為宜，于370C感作30min，然后補加4倍于水泡液的細胞培養(yǎng)液，置370C培養(yǎng)。每天在倒置顯微鏡下觀察2次，48h終判，若細胞培養(yǎng)液對照孔成立，分離病毒的細胞孔細胞出現變圓乃至脫落，則視為細胞病變(CPE)判為陽性，若48h不出現CPE，則應凍融2次，再育傳3代，不出現CPE，判為陰性，出現CPE，則需做進一步鑒定。2.3.2水泡皮的分離，將水泡皮用pH7.2,0.11mol/LPB洗2次一3次，用滅菌濾紙吸去水
6、分，稱其質量后置于加少量石英砂或玻璃砂的研缽中，按質量體積比(1:2)一(1:5)加人pH7.2,0.11mol/I.PB研磨，制成懸液，室溫浸毒Ih或4'C12h，以3000r/min離心20min-30min，取上清液用于病毒分離。2.4乳鼠分離2.4.1乳鼠為2-3日齡小鼠，每份材料接種4只小鼠，每只頂背部皮下接種。.1mI,-O.2mL，在母鼠哺乳下觀察5天。2.4.2若5天內出現神經癥狀乃至死亡，剝皮去頭及內臟，將肌肉及骨胳一起稱量，按質量體積比加9倍的細胞培養(yǎng)液，加玻璃砂研磨制成懸液，置40C浸毒過夜.以1000r/min離心10m
7、in，取上清液用于進一步鑒定。2.5反向間接血凝試驗(RIHA)鑒定分離物GB/T19200-20032.5.1材料準備2.5.1.196孔V型聚乙烯血凝滴定板(110度)，微量振蕩器或微型混合器，0.025m1_0.05mI_稀釋用滴管、乳膠吸頭或25pL,50川一移液加樣器2.5.1.2稀釋液I、稀釋液ll，配制方法見附錄C2.5.1.3標準抗原、標準陽性血清2.5.1.4敏化紅細胞診斷液，效價滴定見附錄Do2.5.2操作方法2.5.2.1使用標準抗原進行豬水泡病與口蹄疫A,O,C,Asia-I型鑒別診斷。2.5.2.1.，被檢樣品的稀釋:
8、把8支試管排列于試管架上，自第1管開始，每管加。.5ml稀釋液I,第一管加。.5ml被檢樣品，由左至右做二倍連續(xù)稀釋(即1，6,1，12,1，24..
