GBT19440-2004 禽流感病毒NASBA檢測方法.pdf

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1、GB/T19440-2004月q呂禽流感由正粘病毒科流感病毒屬中A型流感病毒引起，其中高致病性禽流感因其傳播快、危害大，世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為A類疾病，我國將其列為一類動物疫病。依賴核酸序列的擴增技術(shù)(NASBA)檢測禽流感病毒的敏感性與經(jīng)典的雞胚病原分離方法相當，并具有檢測速度快、特異性強、與雞胚病原分離方法符合率高、易于操作的特點本標準是在綜合我國科研成果的基礎(chǔ)上，參考OIE《診斷試驗和疫苗標準手冊》(2000年版)，并結(jié)合我國現(xiàn)有動物衛(wèi)生法規(guī)及農(nóng)業(yè)部對禽流感的相關(guān)政策和措施制定的。本標準附錄A、附錄B、附錄C為規(guī)范性附錄，附錄D為資料性附錄本標準由

2、上海市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局和中華人民共和國上海出入境檢驗檢疫局提出。本標準由國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局歸口。本標準起草單位:中華人民共和國上海出人境檢驗檢疫局、上海市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局、香港基因晶片開發(fā)有限公司。本標準起草人:單松華、劉樂庭、倪旦紅、胡永強、李樹清.www.bzxzk.com.GB/T19440-2004禽流感病毒NASBA檢測方法范圍本標準規(guī)定了NASBA快速檢測禽流感病毒技術(shù)規(guī)范的材料準備、操作方法和結(jié)果判定。本標準適用于禽類、禽肉產(chǎn)品中所有亞型禽流感病毒的快速檢測、診斷2規(guī)范性引用文件「列文件中的條款通過本標準的引用而成為本標準的條款。凡是注日期的引用文件

3、，其隨后所有的修改單(不包括勘誤的內(nèi)容)或修訂版均不適用于本標準，然而.鼓勵根據(jù)本標準達成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版木。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于木標準。GB/T189362003高致病性禽流感診斷技術(shù)3原理NASBA(Nucleicacidsequence-basedamplification.NASBA，依賴核酸序列的#1增技術(shù))是一項連續(xù)、等溫、基于酶反應(yīng)的核酸擴增技術(shù)該技術(shù)使用三種酶(反轉(zhuǎn)錄酶、核糖核酸酶H,噬菌體T7核糖核酸聚合酶)和兩條寡核昔酸引物卜游引物5‘末端含有噬菌體1'7的依賴于DNA的RNA聚合酶的啟動子序列，下游引

4、物的5‘末端含有和釘標電化學(xué)發(fā)光檢測探針互補的序列。在擴增步驟中，兩個5'端都整合進擴增序列中，這樣既成為產(chǎn)生互補RNA序列的模板，又能特異性結(jié)合檢測步驟中的ECI探針。擴增底物與ECI探針形成復(fù)合物，攜帶該復(fù)合物的磁珠被電極的表面磁性捕獲。電極上的電壓引起電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)。已雜交「的釘標磁珠發(fā)出的光和擴增反應(yīng)產(chǎn)生的RNA擴增產(chǎn)物總量成比例對應(yīng)4材料準備4.1試驗環(huán)境干凈的環(huán)境，最好分區(qū)。分為核酸提取、核酸擴增和核酸檢測三個區(qū)4.2器材采用常規(guī)的分子生物學(xué)器材，包括:一次性手套、移液器(量程5間到200川)、槍頭、無RNA酶的1.弓m工塑料離心管、1.sm工

5、_離心管架、5m工、試管架、旋渦振蕩器、計時器、高速臺式離心機、溫度計(精度士2'C)、加熱器、水浴鍋,5m工_聚丙烯試管(VWR)、封口膜如果采用ECI方法，需要Nuc1iSena閱讀器或者其他等同儀器。如果采用ELISA方法，需要酶標儀4.3引物r_游引物AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGA(A/G)GGCATT(C/T)TGGACAAA(G/T)CGTCTA下游引物GATGCAAGGTCGCATATGAGGAGACTTCTAACCGAGGTCGAAACGTA4.4檢測試劑所有檢測試Pl在使用前，使其達到室溫a)裂解緩沖液:5mol/

6、I、異硫氰酸肌,100oTritonX-100,10mmol/I下ris-HC1,pH8.3;b)沖洗緩沖液:5moll,異硫氰酸肌,10mmol/LTris-HC1.pH8.3;1.www.bzxzk.com.GB/T19440-2004c)500mg/ml硅土:500mg/ml鹽酸活化的二氧化硅;d)洗脫緩沖液:10mmol/LTris-HCI,pH8.3;。)酶溶液(參見附錄A);f)捕捉探針10mmol一工生物素化寡聚核昔酸;探針序列為Biotin-CCGTCAGGCCCCCTCAAAGCCGA9)電化學(xué)發(fā)光法屬別檢測探針(lomMgenericECLdet

7、ectionprobe):釘標記的DNA寡聚核營酸;CTTCTAACCGAGGTCGAAACG丁AECI序列為GATGC八AGGTCGCATATGAGh)儀器調(diào)試參照液:10mmol/l,NASBACPmmol/LTris-HCIpH8.3;3mmol/l.NASBA-ECI;1)檢測稀釋液:15mmol/l.TrisHCl,pH8.3;PBS(137mmol/LNaCl,2.7mmol/I.KCI,1)分析緩沖液:50mmol/LTris-HCl,pH8.3;1X10mmol/LNa,HPO，2mmol/1-KH2P04);翻清洗液:100mmol/LKOH,