Sephadex LH-20 層析原理和應用基礎(chǔ)

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1、摘自HansHenke著PreparativeGelChromatographyonSephadexLH-20SephadexLH-20層析原理和應用基礎(chǔ)1.SephadexLH-20同HPLC和GPC的比較低分子量（分子量<1000）有機化合物在SephadexLH-20上的分離不完全是按分子大小的遞減次序。吸附-層析分離是更為重要的。毫不夸大地說，與純?nèi)軇┳鳛榱鲃酉嗟腟ephadexLH20相比，其它層析分離系統(tǒng)不能顯示被分離物質(zhì)的化學/分子結(jié)構(gòu)和其保留行為之間如此多的相關(guān)性。表1比較和對比了HPLC和GPC和SephadexLH20觀察到的分離機

2、理。這種制成表對比1）的概念是在閱讀了HPLC和GPC結(jié)合的文獻后本作者得到的。事實上，從日常實踐中我們早已知道，分子篩層析和吸附層析在羥丙基化的葡聚糖凝膠(hydroxypropylateddextrangel)上用純?nèi)軇┳鳛榱鲃酉嗍强尚械?。SephadexLH20結(jié)合HPLC和GPC的分離機理并不難懂。換言之，這兩種分離都可以在羥丙基化葡聚糖凝膠上用純?nèi)軇┻M行，即SephadexLH20是一個通用的柱填充材料。在HPLC中，無論是在硅膠上，還是在表面改性的硅膠上，每種分離都需要其自己的分離系統(tǒng)，即固定+流動相。HPLC幾乎總是使用各種梯度的溶劑混合

3、物供選擇的分離系統(tǒng)或分離用?，F(xiàn)在我們來考慮在表1中列舉的分離機理的特征。表1↓開始↓死時間t0AHPLC分離無分離HPLC分離范圍←柱的總死體積→B由分子篩層析分離無分離排阻區(qū)無分離(MSC)按照大小遞減分離C在A和B后在無分離排阻和吸附區(qū)吸附區(qū)SephadexLH-20Vads上分離↑↑↑C=A+B開始V0V0+Vi(加樣)∣∣∣←V0→∣←Vi→∣→→→V0+Vi+Vads∣———————毫升—————————→------關(guān)于A在HPLC中，分離是在死時間t0后開始，因為這是流動相流經(jīng)填充有固定相的柱部分的整個長度所需要的時間或洗脫體積，也稱為死

4、體積，即間隙體積和孔體積。它只能借助于非保留物質(zhì)來測定。換言之，在這一時間之前或這一洗脫體積之前不可能分離。因此，在HPLC中，如果混合物的物質(zhì)受到不同程度保留（可逆相互作用）,分離只可在硅膠（正相）或在表面改性的硅膠（RP、CN、NH2和二元醇相）上進行。關(guān)于B分子篩或體積排阻層析（=SEC）是唯一發(fā)生在孔體積Vi內(nèi)按分子大小(分子體積)降低的次序的分離。在間隙體積V0內(nèi)無分離能發(fā)生，因為大于凝膠最大孔的所有分子未加分離而被洗脫。1)W.Winkle,QuantitativeAnalysisintheV0-Zone,AQuantitativeAprp

5、ooachbyCouplingHPLCwithGPC”inChromatographiaVol.29.(1990)530.1DataFiles：TCM-2003-02AA安瑪西亞中國有限公司摘自HansHenke著PreparativeGelChromatographyonSephadexLH-20所有更小分子的其它化合物隨著其大小降低進入孔體積Vi增加區(qū)，并在以后相應地洗脫。按照反向篩效應的這種層析分離法在洗脫液中最小分子的洗出在最后完成，即V0+Vi之后。對于要分離的物質(zhì)來說，在孔譜中存在的流動相部分連同凝膠基體實際是該分離系統(tǒng)的固定相?？變?nèi)試樣分

6、子的遷移全由擴散發(fā)生。關(guān)于C在分子篩層析（MSC）中主要討論羥丙基化的葡聚糖凝膠SephadexLH-20，當然這決不是全部的真實情況。偶爾提到吸附和分配層析可以在這種凝膠上和G-型凝膠上進行也確是很少。精確地說，這是低分子量有機化合物（MW<1000）的分離，這些化合物有很多，從而使葡聚糖如此有價值，因為就分離機理來說，它確實是通用的固定相。正如由許多實例所證實的，可以有理由地說，用純?nèi)軇┳鳛榱鲃酉嗟腟ephadexLH-20代表A+B的結(jié)合。在該孔體積區(qū)只能以分子大小降低的次序進行分離的說法是不正確的。同樣，同凝膠基體的選擇相互作用可以使吸附層析分

7、離成為可能。在V0+Vi之后洗脫的那些物質(zhì)只容易受到吸附效應的事實不需進一步解釋。低分子量有機化合物的吸附主要是由于在溶解的試樣成分和溶脹的凝膠基體之間生成不同強度的氫鍵和范得華力。2.交聯(lián)的葡聚糖凝膠2.1SephadexLH-20的生產(chǎn)Sephadex葡聚糖凝膠是通過用表氯醇交聯(lián)多葡聚糖得到的。葡聚糖指的是生長在蔗糖底物的細菌Leuconostocmesenteroides的代謝產(chǎn)物的線形的高度聚合的碳水化合物的總稱。每個葡萄糖單元含三個羥基，因此，葡聚糖易溶于水。為了得到不溶于水但可以水溶脹的葡聚糖凝膠，線形多糖鏈需要同雙官能團的表氯醇交聯(lián)。在溶

8、液中相鄰的兩個多糖鏈通過表氯醇交聯(lián)在堿性溶液中通過丙三氧基醚橋發(fā)生，反應式如下（P.Flodi