親和層析原理和步驟.ppt

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1、親和層析AffinityChromatography一、原理親和層析是利用生物大分子所具有的專一親和力而設(shè)計(jì)的純化技術(shù)尋找配基配基固定化制成親和層析柱基本過(guò)程+固相化++洗脫吸附解吸+載體樣品固相化再生酶：基質(zhì)類似物，抑制劑，輔酶抗體：抗原，病毒，細(xì)胞細(xì)胞：細(xì)胞表面特異蛋白，外源凝集素核酸：互補(bǔ)堿基序列，組蛋白，核酸聚合酶激素或藥物：受體，載體蛋白外源凝集素：多糖，糖蛋白，細(xì)胞表面受體，細(xì)胞常見(jiàn)具有專一性親和力的生物分子對(duì)：（一）載體的選擇1、載體要求：（1）不溶性（2）滲透性：疏松網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，有良好的液體流動(dòng)性（3）化學(xué)和機(jī)械性能穩(wěn)定

2、（4）具備大量能被活化的基因（5）抗微生物和酶的侵蝕2、常用載體（1）纖維素特點(diǎn)：價(jià)廉、來(lái)源充足纖維性、非均一性限制大分子的摻入非專一性吸附嚴(yán)重用于抗體和酶的純化（2）葡聚糖凝膠特點(diǎn)：化學(xué)及物理性質(zhì)穩(wěn)定多孔性比瓊脂糖低（3）瓊脂糖凝膠濃度商品2%Sepharose2B4%Sepharose4B6%Sepharose6B凝膠濃度越低結(jié)構(gòu)越疏松機(jī)械強(qiáng)度越低（4）聚丙烯酰胺凝膠（5）多孔玻璃特點(diǎn)：不受微生物的侵蝕耐酸、堿、有機(jī)溶劑表面非專一性吸附特點(diǎn)：物理化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定抗微生物侵蝕能力比瓊脂糖強(qiáng)可供化學(xué)反應(yīng)的酰胺基較多（二）配基的選擇1、對(duì)于

3、欲純化的物質(zhì)應(yīng)有專一親和力2、必須具備能被修飾的功能基團(tuán)以酶和底物為例：E+LELKL=[E][L]/[EL]=[E0-EL][L0-EL]/[EL]E0、L0：起始濃度當(dāng)L0》E0時(shí)KL=[E0-EL][L0]/[EL][EL]=[E0-EL][L0]/KLKd=結(jié)合酶/游離酶=[EL]/[E0-EL]=[L0]/KLKLKL：解離常數(shù)E：酶L：底物EL：復(fù)合物（三）固相化——將配體以共價(jià)鍵連接于固相基質(zhì)上制成固相化吸附劑載體的排斥效應(yīng)載體的空間障礙二、親和層析分離1、裝柱和平衡2、上樣、親和吸附3、洗脫無(wú)效洗脫吸附效率不高有效吸附

4、洗脫方法（1）非特異性洗脫：改變洗脫液pH值離子強(qiáng)度梯度洗脫（2）特殊洗脫：當(dāng)?shù)鞍孜骄o密或上述方法洗脫會(huì)引起失活，可用專一的化學(xué)方法裂解配基與載體的連接鍵，再用透析或凝膠層析法去除配基。斷鍵方法：硫酯鍵、偶氮鍵、二硫鍵（3）專一性洗脫已使用過(guò)和柱，經(jīng)過(guò)再生處理，去除非特異吸附的雜質(zhì)后，可重復(fù)使用再生步驟：起始緩沖液重復(fù)平衡一次用高離子強(qiáng)度和低離子強(qiáng)度溶液處理用弱酸或弱堿溶液處理4、親和柱的再生：三、特點(diǎn)1、一步純化步驟2、產(chǎn)物非常純3、可從很稀的溶液中純化到所需物質(zhì)4、可去除已變性或部分降解物質(zhì)四、應(yīng)用1、分離和純化2、分辨化學(xué)或遺

5、傳學(xué)上修飾的酶3、純化親和標(biāo)記的活化中心肽段和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究4、純化人工合成的多肽和蛋白質(zhì)5、解釋酶作用機(jī)理載體實(shí)驗(yàn)親和層析法分離豌豆凝集素