植物基因轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植物的分析與鑒定

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1、植物基因轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植物的分析與鑒定〖實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?.了解創(chuàng)建煙草突變體庫(kù)的方法;2.理解每種方法的基本原理;3.掌握農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法以及轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物篩選和鑒定的基本過程?!紝?shí)驗(yàn)原理〗隨著越來越多植物的全基因組測(cè)序工作的完成,在此基礎(chǔ)上開展功能基因組的研究是目前的核心研究?jī)?nèi)容之一。植物插入突變體庫(kù)的建立是功能基因組研究的一個(gè)重要內(nèi)容,在此基礎(chǔ)上也能進(jìn)行正向遺傳學(xué)及反向遺傳學(xué)的研究。在創(chuàng)制突變體的策略上,傳統(tǒng)方法是使用物理或化學(xué)誘變方法獲得,其優(yōu)點(diǎn)是可在盡可能短的時(shí)間內(nèi)獲得飽和突變體。與傳統(tǒng)的物理和化學(xué)誘變方法相比,生物誘變(T-DNA和轉(zhuǎn)座子插人誘變)通???/p>

2、標(biāo)記突變基因,從而較為容易地分離鑒定靶基因。最近數(shù)年,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的T-DNA插入突變已成為國(guó)際公認(rèn)的植物功能基因組學(xué)的主要研究方法之一。煙草是植物基因組研究的一種模式植物,其突變體庫(kù)的創(chuàng)建是煙草功能基因組學(xué)研究中的重要內(nèi)容,其目的是通過大規(guī)模的突變體庫(kù)平臺(tái)快速全方位的了解基因組中各個(gè)基因的功能。突變體的創(chuàng)制是遺傳學(xué)研究的基礎(chǔ),也是分離基因和基因功能鑒定的最要途徑。通過誘導(dǎo)培養(yǎng),使煙草產(chǎn)生愈傷組織,利用土壤農(nóng)桿菌感染愈傷組織,實(shí)現(xiàn)T-DNA標(biāo)簽在煙草愈傷組織基因組中大量隨機(jī)插人,利用植物細(xì)胞的全能性,經(jīng)過抗性篩選,誘導(dǎo)分化,從抗性愈傷組織獲得煙草突變體再生植

3、株,獲得各突變體的純合材料,從而建立煙草突變體的數(shù)據(jù)庫(kù),然后分析突變性狀與T-DNA的共分離關(guān)系,存在共分離的材料用適當(dāng)?shù)腡ail-PCR克隆技術(shù)獲得T-DNA的側(cè)翼基因組序列,用其作探針篩選基因文庫(kù),獲取目標(biāo)基因或克隆,再進(jìn)行下一步的分析(圖實(shí)驗(yàn)4-1)。T-DNA載體構(gòu)建轉(zhuǎn)化植物(T1,T-DNA雜合子)收獲T2種子篩選T2,獲突變子,應(yīng)為3:1分離確定T-DNA與突變型共分離的個(gè)體產(chǎn)生純合后代克隆T-DNA兩側(cè)的植物DNA(TailPCR)利用側(cè)翼DNA序列作探針從該植物的cDNA文庫(kù)中釣取基因基因功能的驗(yàn)證(遺傳互補(bǔ)測(cè)驗(yàn),分離的野生基因轉(zhuǎn)化突變體,回復(fù)

4、功能)圖實(shí)驗(yàn)4-1T-DNA標(biāo)簽克隆基因的基本流程TAIL-PCR分離法是利用多個(gè)嵌套的T-DNA插入序列特異性引物(根據(jù)T-DNA中靠近右邊界處的核苷酸序列設(shè)計(jì)的引物,Tm值57-62℃和一個(gè)短的隨機(jī)簡(jiǎn)并引物(AD,Tm值44-46℃)組合,以突變體基因組DNA為模板,進(jìn)行多次PCR反應(yīng),采取高溫特異性擴(kuò)增與低溫隨機(jī)擴(kuò)增相間進(jìn)行的方法,最后獲得T-DNA插入側(cè)翼區(qū)特異性擴(kuò)增片段(實(shí)驗(yàn)圖4-2),可作為探針,篩選分離基因。TAIL-PCR分離法可以降低非側(cè)翼區(qū)特異產(chǎn)物的背景,同時(shí)它可以產(chǎn)生2個(gè)以上嵌套的目的片段,與其它方法相比TAIL-PCR方法具有簡(jiǎn)便、特異

5、、高效、快速和靈敏等特點(diǎn),已經(jīng)在擬南芥和水稻等植物中獲得了成功及廣泛的應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)圖4-2TAIL-PCR反應(yīng)流程圖本實(shí)驗(yàn)用含T-DNA載體質(zhì)粒pCAMBIA1301的LBA4404農(nóng)桿菌菌株轉(zhuǎn)染煙草愈傷組織,讓T-DNA隨機(jī)插入煙草的基因組中形成T-DNA突變體,通過PCR特異擴(kuò)增HPT基因片段來鑒定轉(zhuǎn)基因煙草,以TAIL-PCR法獲得轉(zhuǎn)基因煙草突變體的側(cè)翼基因片段,測(cè)序后將獲得側(cè)翼基因片段的序列與GeneBank中的已知序列對(duì)比,獲得功能基因的全序列?!純x器、材料和試劑〗(一)儀器高速冷凍離心機(jī),PCR儀,超凈工作臺(tái),恒溫?fù)u床,隔水式恒溫培養(yǎng)箱,光照培養(yǎng)箱,

6、紫外可見分光光度計(jì),凝膠成象儀或DarkReader,恒溫水浴鍋,微孔加熱器,電泳儀,水平板電泳槽,天平,酸度計(jì),旋渦混合器。(二)材料煙草幼苗,含T-DNA載體質(zhì)粒pMD83rc的LBA4404農(nóng)桿菌菌株,Ex-taqDNA聚合酶,DNA1kbladdeer,GoldView核酸染料。(三)試劑1.2×CTAB提取液100mmol/LTris-HClpH8.02%(w/v)CTAB1.4mol/LNaCl40mmol/Lb-巰基乙醇20mmol/LEDTA2.TE緩沖液10mmol/LTris-HClpH8.01mmol/LEDTA3.50′TAE電極緩沖液

7、1000mlTris54g硼酸27.5g0.5mol/LEDTA20ml4.10%次氯酸鈉5.氯仿:異戊醇(V:V,24:1)6.70%乙醇7.溶液I:50mmol/L葡萄糖,25mmol/LTris.HCl(pH8.0),10mmol/LEDTA(pH8.0)100ml8.溶液III:60ml5mol/L乙酸鉀,11.5ml11.5%冰乙酸,28.5ml無菌水100ml9.溶液II:分別配制0.4mol/LNaOH和2%SDS溶液(各30ml),用時(shí)1:1混合10.LB液體培養(yǎng)基配制每升培養(yǎng)基,應(yīng)在950mL去離子水中加入:胰蛋白胨(bacto-typton

8、e)10g酵母提取物(bacto-ye

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