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《植物基因轉化及轉基因植物地分析報告與鑒定》由會員上傳分享,免費在線閱讀,更多相關內容在工程資料-天天文庫。
1、實用文檔植物基因轉化及轉基因植物的分析與鑒定〖實驗目的〗1.了解創(chuàng)建煙草突變體庫的方法;2.理解每種方法的基本原理;3.掌握農桿菌介導的轉基因方法以及轉基因產物篩選和鑒定的基本過程。〖實驗原理〗隨著越來越多植物的全基因組測序工作的完成,在此基礎上開展功能基因組的研究是目前的核心研究內容之一。植物插入突變體庫的建立是功能基因組研究的一個重要內容,在此基礎上也能進行正向遺傳學及反向遺傳學的研究。在創(chuàng)制突變體的策略上,傳統(tǒng)方法是使用物理或化學誘變方法獲得,其優(yōu)點是可在盡可能短的時間內獲得飽和突變體。與
2、傳統(tǒng)的物理和化學誘變方法相比,生物誘變(T-DNA和轉座子插人誘變)通??蓸擞浲蛔兓颍瑥亩^為容易地分離鑒定靶基因。最近數年,通過農桿菌介導的T-DNA插入突變已成為國際公認的植物功能基因組學的主要研究方法之一。煙草是植物基因組研究的一種模式植物,其突變體庫的創(chuàng)建是煙草功能基因組學研究中的重要內容,其目的是通過大規(guī)模的突變體庫平臺快速全方位的了解基因組中各個基因的功能。突變體的創(chuàng)制是遺傳學研究的基礎,也是分離基因和基因功能鑒定的最要途徑。通過誘導培養(yǎng),使煙草產生愈傷組織,利用土壤農桿菌感染愈傷
3、組織,實現T-DNA標簽在煙草愈傷組織基因組中大量隨機插人,利用植物細胞的全能性,經過抗性篩選,誘導分化,從抗性愈傷組織獲得煙草突變體再生植株,獲得各突變體的純合材料,從而建立煙草突變體的數據庫,然后分析突變性狀與T-DNA的共分離關系,存在共分離的材料用適當的Tail-PCR克隆技術獲得T-DNA的側翼基因組序列,用其作探針篩選基因文庫,獲取目標基因或克隆,再進行下一步的分析(圖實驗4-1)。T-DNA載體構建轉化植物(T1,T-DNA雜合子)收獲T2種子文案大全實用文檔篩選T2,獲突變子,應
4、為3:1分離確定T-DNA與突變型共分離的個體產生純合后代克隆T-DNA兩側的植物DNA(TailPCR)利用側翼DNA序列作探針從該植物的cDNA文庫中釣取基因基因功能的驗證(遺傳互補測驗,分離的野生基因轉化突變體,回復功能)圖實驗4-1T-DNA標簽克隆基因的基本流程TAIL-PCR分離法是利用多個嵌套的T-DNA插入序列特異性引物(根據T-DNA中靠近右邊界處的核苷酸序列設計的引物,Tm值57-62℃和一個短的隨機簡并引物(AD,Tm值44-46℃)組合,以突變體基因組DNA為模板,進行多
5、次PCR反應,采取高溫特異性擴增與低溫隨機擴增相間進行的方法,最后獲得T-DNA插入側翼區(qū)特異性擴增片段(實驗圖4-2),可作為探針,篩選分離基因。TAIL-PCR分離法可以降低非側翼區(qū)特異產物的背景,同時它可以產生2個以上嵌套的目的片段,與其它方法相比TAIL-PCR方法具有簡便、特異、高效、快速和靈敏等特點,已經在擬南芥和水稻等植物中獲得了成功及廣泛的應用。文案大全實用文檔實驗圖4-2TAIL-PCR反應流程圖本實驗用含T-DNA載體質粒pCAMBIA1301的LBA4404農桿菌菌株轉染煙
6、草愈傷組織,讓T-DNA隨機插入煙草的基因組中形成T-DNA突變體,通過PCR特異擴增HPT基因片段來鑒定轉基因煙草,以TAIL-PCR法獲得轉基因煙草突變體的側翼基因片段,測序后將獲得側翼基因片段的序列與GeneBank中的已知序列對比,獲得功能基因的全序列。〖儀器、材料和試劑〗(一)儀器高速冷凍離心機,PCR儀,超凈工作臺,恒溫搖床,隔水式恒溫培養(yǎng)箱,光照培養(yǎng)箱,紫外可見分光光度計,凝膠成象儀或DarkReader,恒溫水浴鍋,微孔加熱器,電泳儀,水平板電泳槽,天平,酸度計,旋渦混合器。文案
7、大全實用文檔(二)材料煙草幼苗,含T-DNA載體質粒pMD83rc的LBA4404農桿菌菌株,Ex-taqDNA聚合酶,DNA1kbladdeer,GoldView核酸染料。(三)試劑1.2×CTAB提取液100mmol/LTris-HClpH8.02%(w/v)CTAB1.4mol/LNaCl40mmol/Lb-巰基乙醇20mmol/LEDTA2.TE緩沖液10mmol/LTris-HClpH8.01mmol/LEDTA3.50′TAE電極緩沖液1000mlTris54g硼酸27.5g0.5m
8、ol/LEDTA20ml4.10%次氯酸鈉5.氯仿:異戊醇(V:V,24:1)6.70%乙醇7.溶液I:50mmol/L葡萄糖,25mmol/LTris.HCl(pH8.0),10mmol/LEDTA(pH8.0)100ml8.溶液III:60ml5mol/L乙酸鉀,11.5ml11.5%冰乙酸,28.5ml無菌水100ml9.溶液II:分別配制0.4mol/LNaOH和2%SDS溶液(各30ml),用時1:1混合10.LB液體培養(yǎng)基文案大全實用文檔配制每升培養(yǎng)基,應在950mL去離子水中加入: