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《酶活力測定及酶的分離純化》由會(huì)員上傳分享,免費(fèi)在線閱讀,更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。
1、(一)酶的活力測定酶活力是指酶催化某一化學(xué)反應(yīng)的能力,酶活力可以用在一定條件下所催化的某一反應(yīng)的反應(yīng)速度來表示,兩者呈線性關(guān)系。102030405060min產(chǎn)物生成量酶反應(yīng)進(jìn)程曲線酶的活力測定和分離純化用一定時(shí)間內(nèi)底物減少或產(chǎn)物生成的量來表示酶促反應(yīng)速度.測定酶活的方法:終點(diǎn)法:測定完成一定量反應(yīng)所用時(shí)間。動(dòng)力學(xué)法:測定一定時(shí)間所起的化學(xué)反應(yīng)量。(二)酶活力的測定方法1.分光光度法利用底物和產(chǎn)物在紫外或可見光部分的光吸收的不同,選擇一適當(dāng)?shù)牟ㄩL,測定反應(yīng)過程中反應(yīng)進(jìn)行的情況。優(yōu)點(diǎn):簡便、節(jié)省時(shí)間和樣品,可檢測到nmol/L水平的變化。2.熒光法主要是根據(jù)底物或產(chǎn)物的熒光
2、性質(zhì)的差別來進(jìn)行測定。3.同位素測定方法4.電化學(xué)方法酶活力的表示方法活力單位(activeunit)習(xí)慣單位(U):底物(或產(chǎn)物)變化量/單位時(shí)間國際單位(IU):1μmoL變化量/分鐘Katal(Kat):1moL變化量/秒比活力=總活力單位總蛋白mg數(shù)=U(或IU)mg蛋白量度酶催化能力大小轉(zhuǎn)換系數(shù)(Kcat)底物(μmoL)/秒·每個(gè)酶分子量度酶純度比活力(specificactivity)量度轉(zhuǎn)換效率酶的分離提純1、基本原則:提取過程中避免酶變性而失去活性;防止強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、高溫和劇烈攪拌等;要求在低溫下操作,加入的化學(xué)試劑不使酶變性,操作中加入緩沖溶液.2、基本
3、操作程序:選材抽提分離純化微生物、動(dòng)物、植物加入提取液抽提胞內(nèi)酶先破碎先凈化處理再沉淀法分離離子交換層析,凝膠過濾,液相色譜,親和色譜和超濾等酶的保存:1.低溫(0-4℃);2.高濃度較穩(wěn)定;3.加入穩(wěn)定劑;4.固定化。酶的固定化就是把水溶性酶經(jīng)物理(吸附法與包埋法)或化學(xué)方法(共價(jià)偶聯(lián)法與交聯(lián)法)處理后,使酶與惰性載體結(jié)合或?qū)⒚赴衿饋沓蔀橐环N不溶于水的狀態(tài)。1、吸附法:使酶被吸附于惰性固體的表面,或吸附于離子交換劑上。2、包埋法:使酶包埋在凝膠的格子中或聚合物半透膜小膠囊中。3、偶聯(lián)法:使酶通過共價(jià)鍵連接于適當(dāng)?shù)牟蝗苡谒妮d體上。4、交聯(lián)法:使酶分子依靠雙功能基團(tuán)試劑
4、交聯(lián)聚合成“網(wǎng)狀”結(jié)構(gòu)。酶制劑純度的主要指標(biāo)是:A.蛋白質(zhì)的濃度B.酶的總量C.酶的總活性D.酶的比活性D下列哪項(xiàng)條件適合保存酶制劑?A.0℃閉光B.室溫閉光C.-20℃閉光D.室溫光照A作業(yè)P107思考題1、5、6、7第七節(jié)酶工程簡介一、酶工程的概念:酶工程:是指酶制劑在工業(yè)上的大規(guī)模生產(chǎn)及應(yīng)用。1971年第一屆國際酶工程會(huì)議上得到命名。主要研究:酶的生產(chǎn)、純化、固定化技術(shù)、酶分子結(jié)構(gòu)的修飾和改造及其在工、農(nóng)、醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用。天然酶在開發(fā)和應(yīng)用方面受到限制:1.酶的不穩(wěn)定性2.酶的分離、純化較難,成本高,價(jià)格貴目前在酶的應(yīng)用方面所采取的一般方法:1.化學(xué)方法:通過對(duì)酶
5、的化學(xué)修飾或固定化處理,改善酶的性質(zhì)以提高酶的效率和降低成本,或通過化學(xué)合成法制造人工酶。2.利用基因重組技術(shù)生產(chǎn)酶以及對(duì)酶基因進(jìn)行修飾或設(shè)計(jì)新基因,生產(chǎn)出性能穩(wěn)定、具有新的生物活性以及催化效率更高的酶。二、化學(xué)酶工程化學(xué)酶工程亦稱初級(jí)酶工程:指天然酶、化學(xué)修飾酶、固定化酶及人工模擬酶的研究和應(yīng)用。1.天然酶主要指工業(yè)用酶,從微生物發(fā)酵得到的酶。如:洗滌劑、皮革生產(chǎn)中用的蛋白酶;紙張制造用的淀粉酶;乳制品用的凝乳酶等。2.化學(xué)修飾酶:用于醫(yī)藥及研究工作,通過(1)化學(xué)修飾酶的功能基;(2)通過交聯(lián)反應(yīng);(3)大分子修飾作用3.固定化酶:將水溶性酶用物理或化學(xué)方法,使之成為
6、不溶于水的,但仍具有酶活性的狀態(tài)。4.人工模擬酶—化學(xué)法合成酶(已知酶的活性中心和作用機(jī)理)。三、生物酶工程生物酶工程的主要內(nèi)容:克隆酶—用基因工程技術(shù)大量生產(chǎn)酶(?-淀粉酶,青霉素酰胺酶、亮氨酸合成酶)突變酶—對(duì)酶基因進(jìn)行修飾,產(chǎn)生遺傳修飾酶制造新酶—設(shè)計(jì)新酶基因,合成自然界不曾有過的酶生物酶工程亦稱高級(jí)酶工程是酶學(xué)和以DNA重組技術(shù)為主的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物。四、抗體酶抗體酶—指專一于抗原分子的,具有催化活性的免疫球蛋白,即在其高可變區(qū)賦予了酶的屬性。是抗體的高度選擇性與酶的高效催化性相結(jié)合的產(chǎn)物。(五)核酶1.概念核酶:具有催化活性的RNA.2.種類按作用
7、底物分:(1)催化分子內(nèi)反應(yīng)(如自我剪接和自我剪切)的核酶。(2)催化分子間反應(yīng)(如原核生物RNaseP中的RNA)的核酶。本章內(nèi)容結(jié)束,謝謝!