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1、速測卡法（紙片法）2?原理膽堿酯酶可催化靛酚乙酸酯（紅色）水解為乙酸與靛酚（藍色），有機磷或氨基甲酸脂類農(nóng)藥對膽堿酯酶有抑制作用，使催化、水解、變色的過程發(fā)生改變，由此可判斷出樣品中是否有高劑量有機磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥的存在。3試劑3.1固化有膽堿酯酶和靛酚乙酸酯試劑的紙片（速測卡）。3.2pH7.5緩沖溶液：分別取15.0g磷酸氫二鈉[Na2HPO4·12H2O]與1.59g無水磷酸二氫鉀[KH2PO4]，用500mL蒸餾水溶解。4儀器4.1常量天平4.2有條件時配備37℃±2℃恒溫裝置。5分析步驟5.1整體測定法5.1
2、.1選取有代表性的蔬菜樣品，擦去表面泥土，剪成1cm左右見方碎片，取5g放入帶蓋瓶中，加入10mL緩沖溶液，振搖50次，靜置2min以上。5.1.2取一片速測卡，用白色藥片沾取提取液，放置10min以上進行預反應，有條件時在37℃恒溫裝置中放置10min。預反應后的藥片表面必須保持濕潤。5.1.3將速測卡對折，用手捏3min或用恒溫裝置恒溫3min，使紅色藥片與白色藥片疊合發(fā)生反應。5.1.4每批測定應設一個緩沖液的空白對照卡。5.2表面測定法（粗篩法）5.2.1擦去蔬菜表面泥土，滴2滴～3滴緩沖溶液在蔬菜表面，用另一片蔬
3、菜在滴液處輕輕摩擦。5.2.2取一片速測卡，將蔬菜上的液滴滴在白色藥片上。5.2.3放置10min以上進行預反應，有條件時在37℃恒溫裝置中放置10min。預反應后的藥片表面必須保持濕潤。5.2.4將速測卡對折，用手捏3min或用恒溫裝置恒溫3min，使紅色藥片與白色藥片疊合發(fā)生反應。5.2.5每批測定應設一個緩沖液的空白對照卡。6結果判定結果以酶被有機磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥抑制（為陽性）、未抑制（為陰性）表示。與空白對照卡比較，白色藥片不變色或略有淺藍色均為陽性結果。白色藥片變?yōu)樘焖{色或與空白對照卡相同，為陰性結果。對陽性
4、結果的樣品，可用其它分析方法進一步確定具體農(nóng)藥品種和含量。7附則7.1速測卡技術指標7.1.1靈敏度指標：速測卡對部分農(nóng)藥的檢出限見表1。表1部分農(nóng)藥的檢出限 農(nóng)藥名稱檢出限/（mg/kg）農(nóng)藥名稱檢出限/（mg/kg）農(nóng)藥名稱檢出限/（mg/kg）甲胺磷1.7乙酰甲胺磷3.5久效磷2.5對硫磷1.7敵敵畏0.3甲萘威2.5水胺硫磷3.1敵百蟲0.3好年冬1.0馬拉硫磷2.0樂果1.3呋喃丹0.5氧化樂果2.3\\ 7.1.2符合率：在檢出的30份以上陽性樣品中，經(jīng)氣相色譜法驗證，陽性結果的符合率應在80%以上。8說明
5、8.1蔥、蒜、蘿卜、韭菜、芹菜、香菜、茭白、蘑菇及番茄汁液中，含有對酶有影響的植物次生物質(zhì)，容易產(chǎn)生假陽性。處理這類樣品時，可采取整株（體）蔬菜浸提或采用表面測定法。對一些含葉綠素較高的蔬菜，也可采取整株（體）蔬菜浸提的方法，減少色素的干擾。8.2當溫度條件低于37℃，酶反應的速度隨之放慢，藥片加液后放置反應的時間應相對延長，延長時間的確定，應以空白對照卡用手指（體溫）捏3min時可以變藍，即可往下操作。注意樣品放置的時間應與空白對照卡放置的時間一致才有可比性?？瞻讓φ湛ú蛔兩脑颍阂皇撬幤砻婢彌_溶液加的少、預反應后的
6、藥片表面不夠濕潤，二是溫度太低。8.3紅色藥片與白色藥片疊合反應的時間以3min為準，3min后的藍色會逐漸加深，24h后顏色會逐漸退去。酶抑制率法（分光光度法）9原理在一定條件下，有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥對膽堿酯酶正常功能有抑制作用，其抑制率與農(nóng)藥的濃度呈正相關。正常情況下，酶催化神經(jīng)傳導代謝產(chǎn)物（乙酰膽堿）水解，其水解產(chǎn)物與顯色劑反應，產(chǎn)生黃色物質(zhì)，用分光光度計在412nm處測定吸光度隨時間的變化值，計算出抑制率，通過抑制率可以判斷出樣品中是否有高劑量有機磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥的存在。10試劑10.1pH8.0緩沖溶液：
7、分別取11.9g無水磷酸氫二鉀與3.2g磷酸二氫鉀，用1000mL蒸餾水溶解。10.2顯色劑：分別取160mg二硫代二硝基苯甲酸（DTNB）和15.6mg碳酸氫鈉，用20mL緩沖溶液溶解，4℃冰箱中保存。10.3底物：取25.0mg硫代乙酰膽堿，加3.0mL蒸餾水溶解，搖勻后置4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。保存期不超過兩周。10.4乙酰膽堿酯酶：根據(jù)酶的活性情況，用緩沖溶液溶解，3min的吸光度變化D?A?0值應控制在0.3以上。搖勻后置4℃冰箱中保存?zhèn)溆茫４嫫诓怀^四天。10.5可選用由以上試劑制備的試劑盒。乙酰膽堿酯酶的D?A
8、?0值應控制在0.3以上。11儀器11.1分光光度計或相應測定儀。11.2常量天平。11.3恒溫水浴或恒溫箱。12分析步驟12.1樣品處理：選取有代表性的蔬菜樣品，沖洗掉表面泥土，剪成1cm左右見方碎片，取樣品1g，放入燒杯或提取瓶中，加入5mL緩沖溶液，振蕩1min～2min，倒出提取液，靜置3min
