魚(yú)飼料檢測(cè)方法

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1、HPLC檢測(cè)飼料中孔雀石綠的方法孔雀石綠（malachitegreen）又稱為苯胺綠、維多利亞綠或中國(guó)(China)綠，是一種具有金屬光澤的綠色晶體?？兹甘G的化學(xué)官能團(tuán)三苯沼氣(CH4)是一種致癌物資，且其易在魚(yú)體內(nèi)和情況中殘留，存在致突變、致畸和致癌的危險(xiǎn)，故我國(guó)、美國(guó)(UnitedStates)、加拿大(Canada)以及歐盟等很多國(guó)度均制止其在經(jīng)濟(jì)魚(yú)類（觀賞魚(yú)除外）和人類食用魚(yú)中應(yīng)用。魚(yú)粉是飼猜中動(dòng)物卵白的重要起源，含有孔雀石綠及其代謝物的魚(yú)粉添加到飼猜中可經(jīng)由進(jìn)程食品鏈要挾到人類健康。我所現(xiàn)采用

2、NY/T1756-2009標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)用高效液相色譜法（HPLC）對(duì)飼料中孔雀石綠進(jìn)行測(cè)定，本標(biāo)準(zhǔn)適用于配合飼料、濃縮飼料、添加劑預(yù)混合飼料、魚(yú)粉中孔雀石綠和無(wú)色孔雀石綠含量的測(cè)定。液相色譜法孔雀石綠和無(wú)色孔雀石綠的定量限均為10μg/kg；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的定量限均為1.0μg/kg?，F(xiàn)將該方法簡(jiǎn)要介紹如下：1.原理以乙腈-乙酸鈉緩沖溶液提取樣品中的孔雀石綠和無(wú)色孔雀石綠，提取液經(jīng)過(guò)二氯甲烷液液萃取，再經(jīng)固相萃取柱凈化，用接有二氧化鉛柱的氰基柱進(jìn)行高效液相色譜分離，紫外可見(jiàn)光檢測(cè)器檢測(cè)，外標(biāo)法定量。2.

3、分析步驟2.1提取稱取飼料樣品約5g(精確到0.001g)，置于100ml離心管中，依次加入1.5ml鹽酸羥胺溶液、2ml對(duì)甲苯磺酸溶液、5ml乙酸鈉緩沖溶液和20ml乙腈，加入約2g酸性氧化鋁，振蕩2min，超聲30min，4000r/min離心5min。將上清液轉(zhuǎn)移至250ml分液漏斗中，向離心管中再次加入20ml乙腈，振搖2min，4000r/min離心5min，合并上清液至分液漏斗中。2.2液液萃取加入50ml氯化鈉溶液、50ml二氯甲烷，旋搖，靜置分層。用蒸發(fā)瓶收集下層液體后，在分液漏斗再次加入

4、20ml二氯甲烷，旋搖，靜置分層，收集下層液體于同一蒸發(fā)瓶。將收集液35℃下減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(注意：開(kāi)始時(shí)溫度不要直接升35℃，以免爆沸)至近干，加入5ml，乙腈溶解殘?jiān)?，備用?.3凈化2.3.1固相萃取柱的活化按中性氧化鋁柱在上、PRS柱在下的順序?qū)芍?lián)，使用前用5ml乙腈預(yù)洗兩柱。2.3.2上樣將2.3.1的樣液緩慢轉(zhuǎn)移到中性氧化鋁柱內(nèi),在抽真空情況下過(guò)柱(保持流速1ml／min)。再用5ml乙腈洗滌蒸發(fā)瓶2次，洗滌液均轉(zhuǎn)移至柱內(nèi)，最后用5ml乙腈洗滌小柱。2.3.3洗脫收集棄去中性氧化鋁柱，用乙腈

5、-乙酸鈉緩沖溶液2ml、鹽酸羥胺甲醇溶液lml洗脫，收集洗脫液，過(guò)膜(孔徑0.45μm)，上機(jī)測(cè)定。2.4樣品測(cè)定2.4.1色譜條件色譜柱：氰基柱，250mm×4.6mm，柱后氧化鉛柱：35mm×4.6mm。流動(dòng)相：乙腈＋乙酸鈉緩沖溶液＝60＋40(v＋v)；流速：1.0ml/min。柱溫：室溫。進(jìn)樣量：50μl。檢測(cè)波長(zhǎng)：600nm。2.4.2定量測(cè)定按高效液相色譜儀說(shuō)明書(shū)調(diào)整儀器操作參數(shù)。向液相色譜儀中注入孔雀石綠和無(wú)色孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)工作液及試樣溶液，得到色譜峰面積響應(yīng)值，用外標(biāo)法定量。1氯霉素類藥物概

6、述氯霉素類藥物是應(yīng)用廣泛的廣譜抗生素，常用于動(dòng)物各種傳染性疾病的治療中，對(duì)各類家禽、家畜、水產(chǎn)品及蜂蜜制品各種傳染性疾病的控制和治療起重要作用。氯霉素最初是從委內(nèi)瑞拉鏈絲菌的培養(yǎng)液中提取制得，現(xiàn)在基本使用化學(xué)合成法大量生產(chǎn)。其性質(zhì)穩(wěn)定，在干燥狀態(tài)下可保存藥效達(dá)2年以上，易溶于有機(jī)溶劑，25℃時(shí)100ml水中僅溶解25mg。水溶液呈中性，在酸性和中性溶液中較穩(wěn)定，遇堿類易分解失效。其合成品具有左旋光性，也稱左霉素。2氯霉素殘留對(duì)人類健康的危害2.1骨髓造血機(jī)能紊亂氯霉素對(duì)骨髓造血機(jī)能有抑制作用，可引起血小板

7、減少性紫癜、粒細(xì)胞缺乏癥、再生障礙性貧血、溶血性等，多數(shù)在長(zhǎng)期或多次用藥的過(guò)程中發(fā)生。2.2對(duì)早產(chǎn)兒和新生兒的毒性在早產(chǎn)兒和新生兒肝內(nèi)有些酶系統(tǒng)發(fā)育尚不完全，葡萄糖醛酸結(jié)合的能力較差，因此影響氯霉素在肝中的解毒作用；此外，腎臟排泄能力亦較弱，能招致藥物蓄積中毒。2.3胃腸道癥狀、口部癥狀胃腸道反應(yīng)主要有腹脹、腹瀉、食欲減退，惡心、嘔吐則少見(jiàn)?？诓堪Y狀如口腔粘膜充血、疼痛、糜爛、口角炎和舌炎等。2.4其它不良反應(yīng)可引起視神經(jīng)炎、視力障礙、多發(fā)性神經(jīng)炎、神經(jīng)性耳聾以及嚴(yán)重失眠。有時(shí)發(fā)生中毒性精神病，主要表現(xiàn)為

8、幻視、幻聽(tīng)、定向力喪失、精神失常等。3氯霉素殘留對(duì)我國(guó)動(dòng)物產(chǎn)品出口的影響氯霉素殘留問(wèn)題已引起國(guó)際組織和世界上許多國(guó)家和地區(qū)的高度重視。歐盟、美國(guó)等均在法規(guī)中規(guī)定氯霉素殘留限量標(biāo)準(zhǔn)為“零容許量”，即不得檢出。幾年來(lái)，我國(guó)出口到歐盟、美國(guó)等地區(qū)的水產(chǎn)品、蜂蜜等多次因?yàn)槁让顾爻瑯?biāo)被限制，損失達(dá)到數(shù)十億美元。4氯霉素殘留檢測(cè)方法近年來(lái)各種關(guān)于氯霉素殘留的檢測(cè)方法不斷涌現(xiàn)，大致可分為三大類：第一類是生物測(cè)定法，第二類是理化分析法，第三類