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《實時熒光定量pcr技術(shù)原理與應(yīng)用》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。
1、實時熒光定量?PCR技術(shù)原理與應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)可對特定核苷酸片斷進(jìn)行指數(shù)級的擴增。在擴增反應(yīng)結(jié)束之后，我們可以通過凝膠電泳的方法對擴增產(chǎn)物進(jìn)行定性的分析，也可以通過放射性核素?fù)饺霕?biāo)記后的光密度掃描來進(jìn)行定量的分析。無論定性還是定量分析，分析的都是PCR終產(chǎn)物。但是在許多情況下，我們所感興趣的是未經(jīng)PCR信號放大之前的起始模板量。例如我們想知道某一轉(zhuǎn)基因動植物轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)或者某一特定基因在特定組織中的表達(dá)量。在這種需求下熒光定量PCR技術(shù)應(yīng)運而生。所謂的實時熒光定量PCR就是通過對PCR擴增反應(yīng)中每
2、一個循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實時檢測從而實現(xiàn)對起始模板定量及定性的分析。在實時熒光定量PCR反應(yīng)中，引入了一種熒光化學(xué)物質(zhì)，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計，熒光信號強度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光強度信號，這樣我們就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴增曲線圖(如圖1，2)。圖1實時熒光擴增曲線圖圖2實時熒光擴增曲線圖一般而言，熒光擴增曲線擴增曲線可以分成三個階段：熒光背景信號階段,熒光信號指數(shù)擴增階段和平臺期。在熒光背景信號階段，擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，我
3、們無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺期，擴增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加。PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，所以根據(jù)最終的PCR產(chǎn)物量不能計算出起始DNA拷貝數(shù)。只有在熒光信號指數(shù)擴增階段，PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，我們可以選擇在這個階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便，在實時熒光定量PCR技術(shù)中引入了兩個非常重要的概念：熒光閾值和CT值。熒光閾值是在熒光擴增曲線上人為設(shè)定的一個值，它可以設(shè)定在熒光信號指數(shù)擴增階段任意位置上，但一般我們將熒光域值的缺省設(shè)置是3-15個循環(huán)的熒光信號
4、的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被稱為CT值（thresholdvalue）。CT值與起始模板的關(guān)系研究表明，每個模板的CT值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，CT值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標(biāo)代表Ct值（如圖3所示）。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。圖2.熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線熒光探針和熒光染料實時熒光定量PCR的化學(xué)原理包括探針類和非探針類兩種，探針類是
5、利用與靶序列特異雜交的探針來指示擴增產(chǎn)物的增加，非探針類則是利用熒光染料或者特殊設(shè)計的引物來指示擴增的增加。前者由于增加了探針的識別步驟，特異性更高，但后者則簡便易行。1．SYBRGreenI圖4SYBRGREENI工作原理SYBRGreenI是一種結(jié)合于小溝中的雙鏈DNA結(jié)合染料。與雙鏈DNA結(jié)合后，其熒光大大增強。這一性質(zhì)使其用于擴增產(chǎn)物的檢測非常理想。SYBRGreenI的最大吸收波長約為497nm，發(fā)射波長最大約為520nm。在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓N
6、A雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。SYBRGreenI在核酸的實時檢測方面有很多優(yōu)點，由于它與所有的雙鏈DNA相結(jié)合，不必因為模板不同而特別定制，因此設(shè)計的程序通用性好，且價格相對較低。利用熒光染料可以指示雙鏈DNA熔點的性質(zhì)，通過熔點曲線分析可以識別擴增產(chǎn)物和引物二聚體，因而可以、區(qū)分非特異擴增，進(jìn)一步地還可以實現(xiàn)單色多重測定。此外，由于一個PCR產(chǎn)物可以與多分子的染料結(jié)合，因此SYBRGreenI的靈敏度很高。但是，
7、由于SYBRGreenI與所有的雙鏈DNA相結(jié)合，因此由引物二聚體、單鏈二級結(jié)構(gòu)以及錯誤的擴增產(chǎn)物引起的假陽性會影響定量的精確性。通過測量升高溫度后熒光的變化可以幫助降低非特異產(chǎn)物的影響1。由解鏈曲線來分析產(chǎn)物的均一性有助于分析由SYBRGreenI得到定量結(jié)果。2．分子信標(biāo)（molecularbeacon）分子信標(biāo)是一種在靶DNA不存在時形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的雙標(biāo)記寡核苷酸探針。在此發(fā)夾結(jié)構(gòu)中，位于分子一端的熒光基團與分子另一端的淬滅基團緊緊靠近。在此結(jié)構(gòu)中，熒光基團被激發(fā)后不是產(chǎn)生光子，而是將能量傳遞給淬滅劑，這一
8、過程稱為熒光諧振能量傳遞（FRET）。由于"黑色"淬滅劑的存在，由熒光基團產(chǎn)生的能量以紅外而不是可見光形式釋放出來。如果第二個熒光基團是淬滅劑，其釋放能量的波長與熒光基團的性質(zhì)有關(guān)。分子信標(biāo)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)中，環(huán)一般為15-30個核苷酸長，并與目標(biāo)序列互補；莖一般5-7個核苷酸長，并相互配對形成莖的結(jié)構(gòu)。熒光基團連接在莖臂的一端，而淬滅劑則連接于另一端。分子信標(biāo)必須非常仔細(xì)的設(shè)計，以致于在復(fù)
