分子標(biāo)記技術(shù)(ISSR)

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1、ISSR(Inter-simplesequencerepeat)分子標(biāo)記技術(shù)主講人：關(guān)錳分子標(biāo)記的概念廣義的分子標(biāo)記(molecularmarker)是指可遺傳的并可檢測的DNA序列或蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)標(biāo)記包括種子貯藏蛋白和同工酶（指由一個以上基因位點編碼的酶的不同分子形式）及等位酶（指由同一基因位點的不同等位基因編碼的酶的不同分子形式）。狹義的分子標(biāo)記概念只是指DNA標(biāo)記，而這個界定現(xiàn)在被廣泛采納：能反映生物個體或種群間基因組中某種差異特征的DNA片段，它直接反映基因組DNA間的差異。分子標(biāo)記的特點（1）直接以DNA的形式表現(xiàn)，在生物體的各個組織

2、、各個發(fā)育階段均可檢測到，不受季節(jié)、環(huán)境限制，不存在表達(dá)與否等問題；（2）數(shù)量極多，遍布整個基因組，可檢測座位幾乎無限；（3）多態(tài)性高，自然界存在許多等位變異，無須人為創(chuàng)造；（4）表現(xiàn)為中性，不影響目標(biāo)性狀的表達(dá)；（5）許多標(biāo)記表現(xiàn)為共顯性的特點，能區(qū)別純合體和雜合體。分子標(biāo)記的類型①基于雜交的分子標(biāo)記，如RFLP（Restrictionfragmentlengthpolymorphism,即限制性長度片段多態(tài)性）。②基于DNA序列和芯片的分子標(biāo)記，如SNP（Singlenucleotidepolymorphism，單核苷酸多態(tài)性）。③基于PC

3、R的分子標(biāo)記，它又分為兩類：RAPD（RandomamplifiedpolymorphicDNA）DAF（DNAamplificationfingerprinting）SSCP（Singlestrandconfirmationalpolymorphism）小衛(wèi)星DNA（MinisatelliteDNA）微衛(wèi)星DNA（MicrosatelliteDNA）,又稱SSR（Simplesequencerepeat）ISSR（Intersimplesequencerepeat）AP-PCR（ArbitraryprimerPCR）它主要有SCAR（Sequ

4、encecharacterizedamplifiedregion）STS(Sequencetaggedsite)位點特異的PCR標(biāo)記方法多位點標(biāo)記方法基于PCR技術(shù)的DNA擴(kuò)增方法AFLP（Amplifiedfragmentlengthpolymorphism）AFLP是先酶切，再用特殊設(shè)計的引物進(jìn)行擴(kuò)增CAPS（Cleavedamplifiedpolymorphicsequence）CAPS是先擴(kuò)增，再酶切擴(kuò)增片段PCR與酶切相結(jié)合的方法微衛(wèi)星DNAMicrosatellite，MS/SimpleSequenceRepeat,SSR短的，簡單

5、的串聯(lián)重復(fù)序列；基元是1-6個堿基(有的定義為1-5個堿基)；廣泛存在于真核細(xì)胞整個基因組的不同位置上；高度多態(tài)性(微衛(wèi)星DNA長度的多態(tài)性)；微衛(wèi)星DNA兩端多是高度保守的單拷貝序列；共顯性標(biāo)記。特點ISSR原理簡介ISSR(inter-simplesequencerepeat)是Zietkeiwitcz等于1994年在微衛(wèi)星基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新的分子標(biāo)記。其基本原理是:用錨定的微衛(wèi)星DNA為引物，即在SSR序列的3‘端或5’端加上2-4個隨機(jī)核昔酸，在PCR反應(yīng)中，錨定引物可引起特定位點退火，導(dǎo)致與錨定引物互補(bǔ)的間隔不太大的重復(fù)序列間DN

6、A片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所擴(kuò)增的兩個SSR區(qū)域之間的多個條帶通過聚丙烯酞胺凝膠電泳得以分辨，擴(kuò)增譜帶多為顯性表現(xiàn)。由于微衛(wèi)星在基因組中廣泛分布，且等位變異特別豐富，因而可以檢測到高的多態(tài)性。ISSR分子標(biāo)記的特點優(yōu)點：ISSR標(biāo)記結(jié)合了RAPD和SSR的優(yōu)點,所需DNA模板的量少、多態(tài)性豐富,無需試劑盒、結(jié)果記錄方便、實驗成本低、操作簡單、穩(wěn)定性較高、呈孟德爾式遺傳缺點：是PCR擴(kuò)增時最適反應(yīng)條件需要一定時間摸索,其標(biāo)記大多為顯性標(biāo)記,在解決交配系統(tǒng)、計算雜合度和父系分析等問題時效果不佳特性RFLPRAPDSSRISSRAFLP分布普遍存在普遍存

7、在普遍存在普遍存在普遍存在遺傳共顯性多數(shù)顯性共顯性多數(shù)顯性多數(shù)顯性多態(tài)性中高高高非常高等位檢測是不是是不是不是檢測位點數(shù)1~31~101~50~50~更多20~100樣品信息量低~中高高高非常高基因組區(qū)域底拷貝編碼整個基因組整個基因組整個基因組整個基因組技術(shù)難度中等簡單簡單簡單中等重復(fù)性高中等高高高DNA樣品量2~30μg1~100ng50-100ng2~50ng100ng耗費(fèi)時間慢快快快中等可靠性高中等高高高ISSR實驗流程DNA提取及檢測引物設(shè)計PCR擴(kuò)增電泳檢測結(jié)果統(tǒng)計及分析必須對擴(kuò)增條件進(jìn)行優(yōu)化，包括對Tag酶、引物濃度及其退火溫度、M

8、g2+濃度、模板濃度等。引物設(shè)計是ISSR技術(shù)中最關(guān)鍵、最重要的一步?；蚪M中SSR一般為2~6個寡聚核苷酸，用于ISSR的引物常為5’或3’端加錨定