巴斯德畢赤酵母高效表達(dá)外源蛋白的策略

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1、維普資訊http://www.cqvip.com海峽藥學(xué)2007年第19卷第2期巴斯德畢赤酵母高效表達(dá)外源蛋白的策略駱詩(shī)鴻(廈門(mén)特寶生物工程股份有限公司廈門(mén)350005)摘要：巴氏畢赤酵母(Pichiapastoris)是表達(dá)外源蛋白最理想的真核表達(dá)系統(tǒng)之一。要在一種宿主表達(dá)系統(tǒng)中成功表達(dá)外源蛋白并獲得較高產(chǎn)量·必須要較為全面地了解影響其表達(dá)的諸多因素。本文綜述了應(yīng)用該體系高效表達(dá)外源蛋白需考慮的策略關(guān)鍵詞：畢赤酵母；高效表達(dá)；策略中圖分類(lèi)號(hào)：R92文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1006—3765(2007)02—

2、000404表達(dá)系統(tǒng)是基因工程及生物制藥研究和應(yīng)用的重要內(nèi)達(dá)的各種因素，并闡述了優(yōu)化外源蛋白在P．pastoris中高效容，也是生命科學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。長(zhǎng)期以來(lái)，大腸桿菌一直表達(dá)的策略。被用作表達(dá)外源基因的宿主菌，并成功地表達(dá)了多種外源蛋1外源基因的內(nèi)在特性白，但是它不能表達(dá)結(jié)構(gòu)復(fù)雜的蛋白質(zhì)，且分泌型表達(dá)產(chǎn)量較主要包括mRNA5’端非翻譯區(qū)(5’一UTR)、基因的A+低。而哺乳類(lèi)細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)雖然能夠表達(dá)結(jié)構(gòu)復(fù)雜T組成和密碼子的使用頻率3個(gè)方面。5’一UTR的核苷酸序的真核細(xì)胞蛋白成分，但操作復(fù)雜，表

3、達(dá)水平低，產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)列和長(zhǎng)度影響外源基因的表達(dá)，由于巴斯德畢赤酵母中乙醇造價(jià)昂貴，不易普遍推廣使用。酵母是單細(xì)胞低等真核生物，氧化酶的表達(dá)量極高(占胞內(nèi)可溶蛋白的3O％以上)，極少有它既具有原核生物易于培養(yǎng)、繁殖快、便于基因工程操作和高外源蛋白能達(dá)到這么高的水平，因此為了有高的蛋白表達(dá)量，密度發(fā)酵等特性，同時(shí)又具有適于真核生物基因產(chǎn)物正確折維持外源基因mRNA5UTR。盡可能和A0XlmRNA5一疊的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境和糖鏈加工系統(tǒng)，還能分泌外源蛋白到培養(yǎng)UTR相似是必需的，最好是保持兩者一致。A+T含量高的液中，利

4、于純化。因此，最近10多年來(lái)，酵母被認(rèn)為是一個(gè)很基因在巴斯德畢赤酵母中表達(dá)時(shí)偶爾會(huì)造成轉(zhuǎn)錄提前終止，有前途的真核表達(dá)系統(tǒng)而受到廣泛的關(guān)注由于發(fā)酵和釀造這是因?yàn)锳T豐富區(qū)可能存在轉(zhuǎn)錄提前終止信號(hào)。因此對(duì)工業(yè)的發(fā)展，人們對(duì)釀酒酵母的遺傳背景和生物學(xué)特性研究AT含量豐富的基因最好是重新設(shè)計(jì)序列，使其A+T含量得比較透徹，且其表達(dá)的安全性易被接受。因此，釀酒酵母首在3O％～55％范圍內(nèi)。用這種方法使破傷風(fēng)毒素C片段得到先被用來(lái)作為外源基因的表達(dá)宿主菌，然而其表達(dá)重組蛋白高效表達(dá)。Patn等通過(guò)對(duì)110個(gè)酵母基因使用密

5、碼子的統(tǒng)計(jì)有一定的局限性?；卺劸平湍傅木窒扌?，人們用其他酵母菌學(xué)分析，確證了密碼子的偏愛(ài)性與基因的表達(dá)量密切相關(guān)。在株構(gòu)建了可高效穩(wěn)定表達(dá)外源基因的新表達(dá)系統(tǒng)，即甲醇營(yíng)酵母中表達(dá)量較高的基因往往采用的是酵母所偏愛(ài)的密碼養(yǎng)型酵母表達(dá)系統(tǒng)。作為第2代酵母表達(dá)系統(tǒng)，它克服了釀酒子。趙翔等通過(guò)分析巴斯德畢赤酵母的28個(gè)蛋白編碼基因的酵母表達(dá)系統(tǒng)的諸多不足，成為國(guó)內(nèi)外廣泛應(yīng)用的大量生產(chǎn)同義密碼子使用情況，計(jì)算出該酵母的密碼子用法，并確定出外源真核或其他結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜的原核蛋白的一個(gè)較為理想的巴斯德畢赤酵母的19個(gè)高表達(dá)

6、優(yōu)越密碼子“。表達(dá)系統(tǒng)。畢赤酵母是一種單細(xì)胞真核生物，近十年來(lái)被作為2選擇強(qiáng)啟動(dòng)子真核表達(dá)系統(tǒng)而用于外源蛋白質(zhì)的生產(chǎn)，作為一種成功的表P．pastoris載體中最常用的啟動(dòng)子為AOXl啟動(dòng)子，它的達(dá)體系，其優(yōu)點(diǎn)在于：具有強(qiáng)有力的甲醇氧化酶基因(AOXI)甲醇誘導(dǎo)性很強(qiáng)，因此，由它控制的外源基因通常能得到高效啟動(dòng)子，可嚴(yán)格調(diào)控外源基因的表達(dá)；能高密度發(fā)酵培養(yǎng)，而表達(dá)。也有人曾用P和Po^s啟動(dòng)子，但二者的強(qiáng)度大大低且營(yíng)養(yǎng)要求低，利于工業(yè)化放大生產(chǎn)；自身分泌的蛋白質(zhì)非常于P。如果帶有外源基因的載體通過(guò)雙交換整合P

7、．少，使高分泌的外源蛋白質(zhì)便于純化；外源基因通過(guò)整合型質(zhì)pastoris的AOX1基因位置時(shí)，AOX1基因?qū)⒈黄茐?。雖然粒進(jìn)入畢赤酵母染色體基因組，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不易丟失}自身含AOX2和AOX1基因的序列同源性高達(dá)97％，但AOX1基因有亞細(xì)胞器結(jié)構(gòu)，可對(duì)表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行翻譯后的修飾如信表達(dá)產(chǎn)物在正常細(xì)胞中僅占總酶量的5％。這樣就使細(xì)胞利號(hào)序列的加工；蛋白質(zhì)的折疊；二硫鍵形成以及糖基化；基因用甲醇的能力大大下降，從而使表達(dá)下降且延長(zhǎng)了細(xì)胞發(fā)酵表達(dá)的產(chǎn)物既可在胞內(nèi)積聚，又可分泌到胞外；外源蛋白質(zhì)的時(shí)間。為了克服這

8、一缺點(diǎn)，戴秀玉等通過(guò)分離選擇恢復(fù)利用表達(dá)量較高，如轉(zhuǎn)化酵素2．3g·L_。，牛溶菌酶CO，55g·甲醇能力的自發(fā)突變體，從AOX1基因缺陷菌株中分離得到L一。溶栓酶0．08g·LI。，A一淀粉酶2．5g·L一，果膠裂解酶Mut+的自發(fā)突變體，他們對(duì)突變體的AOX2基因上游區(qū)域0．O04g·L一。破傷風(fēng)毒素片段C12．Og·L～，百日咳抗原經(jīng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序、確定了該突變體在一255和一529兩P6