畢赤酵母高效表達策略概述

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1、-畢赤酵母高效表達策略概述1.基因的內(nèi)在特性主要包括mRNA5’端非翻譯區(qū)(5’2UTR)、基因的A+T組成和密碼子的使用頻率3個方面。由于巴斯德畢赤酵母中乙醇氧化酶的表達量極高(占胞內(nèi)可溶蛋白的30%以上)因此為了有高的蛋白表達量,維持外源基因mRNA5’－UTR。盡可能和AOXlmRNA5’－UTR相似是必需的,最好是保持兩者一致。A+T含量高的基因在巴斯德畢赤酵母中表達時偶爾會造成轉錄提前終止,這是因為AT豐富區(qū)可能存在轉錄提前終止信號。因此對AT含量豐富的基因最好是重新設計序列,使其A+T含

2、量在30%～55%范圍內(nèi)。巴斯德畢赤酵母也有特殊的密碼子偏好趨向。（趙翔,霍克克,李育陽.畢赤酵母的密碼子用法分析[J].生物工程學報,2000,16(3):308-311.）外源蛋白自身的理化特點也影響其表達和分泌。外源蛋白的加工修飾都會影響蛋白的表達量。2．選擇強啟動子啟動子在轉錄水平上調(diào)控基因的表達最常用的啟動子是AOXI啟動子。PGAG(三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子)是最近在巴斯德畢赤酵母中克隆到的一個組成型啟動子,在它的控制下β-LabZ基因表達率比甲醇誘導下的PAOX驅動的產(chǎn)量更高,由于該組

3、成型啟動子不需要甲醇誘導,發(fā)酵工藝應該更簡單,同時其產(chǎn)量更高,所以成為代替PAOX1最有潛力的啟動子。通過分離選擇恢復利用甲醇能力的自發(fā)突變體,從AOX1基因缺陷菌株中分離Mut+的自發(fā)突變體，從中篩選提高表達量的突變體。（戴秀玉,王恂,周堅1畢赤氏酵母PAOX2突變化序列分析〔J〕1微生物學報,1999,39(6):559～5611）3．增加外源基因整合拷貝數(shù)（1）Invitrogen公司最新發(fā)展的質(zhì)粒pPIC9K上帶有G418的抗性基因,可以通過轉化子對G418抗性水平快速篩選高拷貝轉化子（配合

4、電激法轉化的效果更好）。（2）在體外載體上多次插入目的基因片段。（3）將載體中目的基因兩端連上來自宿主或其它非必需高重復的基因片段,通過同源重組而達到高拷貝整合的目的。（聶東宋,梁宋平,李敏1外源蛋白在巴氏畢赤酵母中高效表達的策略〔J〕1吉首大學學報(自然科學版),2001,22(3):40～41）4．載體和宿主的選擇KM71轉化子是muts表型,而GS115轉化子主要是mut+表型,也有一小部分是muts表型。哪一種表型對外源蛋白的表達量更高,對每一種蛋白而言是不確定的。信號肽也是影響分泌表達水平

5、的很重要因素。α-交配因子和目的基因之間插入一個間隔肽(spacerpeptide)可以提高外源蛋白的表達水平。（王燕,梁鎮(zhèn)和,張友尚,等.人胰島素在甲醇酵母Pichiapastoris中的分泌表達[J].生物化學與生物物理學報,1999:31(5):587-589.）5．優(yōu)化發(fā)酵條件發(fā)酵條件主要包括通氣量、溫度、pH、甲醇含量和培養(yǎng)時間等。5．1通氣量是影響表達水平的極為重要的因素。用發(fā)酵罐進行培養(yǎng),外源蛋白的表達水平要比普通搖瓶發(fā)酵高出10～100倍.主要原因是普通搖瓶發(fā)酵的通氣不理想,影響了菌

6、體的高密度生長及表達。許多文獻報道的表達水平都是搖瓶發(fā)酵條件下的結果,可以推測,如果用發(fā)酵罐進行培養(yǎng),表達水平還會有上升的空間。5．2碳源也是影響高水平表達的重要因素。畢赤酵母表達培養(yǎng)基常用的碳源是甘油,但甘油對AOX啟動子有抑制作用。山梨糖醇代替甘油作為碳源,結果生物質(zhì)量下降,但外源蛋白的表達有所提高5．3培養(yǎng)基組成目前主要有BMGY、FBS2種培養(yǎng)基可用于培養(yǎng)P.pastoris。但由于BMGY既含有磷酸緩沖液又含蛋白胨和酵母提取物,因而菌株生長更好,大大增加了生物量,使表達量也相應大大提高。5

7、．4甲醇誘導的方式、用量、誘導時間誘導的方式：兩步法(先用甘油培養(yǎng)使細胞達到一定的濃度,再加甲醇誘導)和聯(lián)合生長培養(yǎng)的方法(growth-associated,在早期加入甲醇誘導)來誘導外源蛋白的表達都有成功的報道?，F(xiàn)在一般兩步法來誘導外源蛋白的表達。用兩步法來誘導外源蛋白的表達,則誘導時的起始pH可能是畢赤酵母高效表達重組蛋白的關鍵之一,通過改變誘導時的pH值,可使表達量提高50%以上。（邱榮德,朱建蓓,王壘,等.人p53蛋白在巴斯德畢赤酵母中的表達[J].生物工程學報,1999,15(4):47

8、7-481.）growth-associated是誘導甲醇酵母高水平表達外源基因的很好方法,比普通方法高出10倍（OhashiR,MochizukiE,SuzukiT.Amini-scalemassproductionandseparationsystemforsecretoryheterologousproteinsbyperfusioncultureofrecombinantPichiapastorisusingashakenceramicmembraneflas