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《染色體熒光原位雜交技術(shù)》由會(huì)員上傳分享,免費(fèi)在線閱讀,更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。
1、染色體熒光原位雜交技術(shù)摘要FISH(FluoresenceInSituHybridization)技術(shù)是80年代開始發(fā)展起來的一種新的定位技術(shù)。在人類基因組研究中得到了廣泛的應(yīng)用.通過中期染色體的FISH可以進(jìn)行SCP,Cosmid和YAC的染色體定位,嵌合克隆的鑒別,通過間期核的FISH可以在50kb的分辨率下進(jìn)行基因作圖,最新的研究進(jìn)展已可以進(jìn)行伸展的染色質(zhì)絲(chromatinfibre)的FISH,直接測(cè)量基因的長度、從而達(dá)到高精度基因作圖的目的。隨著FISH技術(shù)發(fā)展,它將在人類以及其它物種基因組研究中發(fā)揮更大的作用。熒光標(biāo)記的染色體原位雜交技術(shù)提供了一
2、種快速而有效的手段,將DNA片段和特定的真核生物細(xì)胞的染色體區(qū)帶聯(lián)系了起來,并將這些DNA片段排序,這是研究DNA順序在染色體上位置的最直接的方法。最早,人們根據(jù)Gall和Pardue在1969年的工作,于70年代,建立起了同位素原位雜交技術(shù),但當(dāng)時(shí)只是用于DNA順序在多線染色體上的定位或是重復(fù)順序在中期染色體上的定位。1981,Gerhard和Harper等首先證明有可能將從個(gè)體基因中得到的單拷貝順序(SCP,singlecopyprobe)通過同位素原位雜交技術(shù)定位到中期染色體上。在此基礎(chǔ)上,80年代初起,熒光標(biāo)記的原位雜交技術(shù)開始起步并得到運(yùn)用且不斷地發(fā)展
3、起來。1、FISH技術(shù)簡(jiǎn)介FISH技術(shù)包括下列幾個(gè)步驟:1、探針的準(zhǔn)備和標(biāo)記;2、探針和染色體的雜交;3、信號(hào)檢測(cè);4、雜交信號(hào)與分帶染色體的比較。1.1探針的準(zhǔn)備探針標(biāo)記時(shí)可采用兩種基本方式:(1)直接標(biāo)記法:將熒光分子直接標(biāo)記于探針DNA/RNA上,雜交后可直接在熒光顯微鏡下檢測(cè)。這種方式快速簡(jiǎn)捷,由于雜交信號(hào)較弱、且不能進(jìn)一步放大,以前這種方法用得不多,但它有背景少的優(yōu)點(diǎn),近來在一些公司的試劑盒中得到應(yīng)用。(2)間接標(biāo)記法:常用的間接法是將一些類似于半抗原(hapten)的標(biāo)記分子摻入探針分子中。用的較多的試劑有生物素,地谷新(digoxigenin),二
4、硝基苯(dinitrophenyl,DNP),氨基乙酰茐(aminoacetylfuorene,AAF),汞和磺酸鹽(sulfonate)。就摻入方式來說,生物素,地谷新等是以核苷酸衍生物的形式摻入的,可用切口平移法來進(jìn)行?,F(xiàn)在更多的人開始用隨機(jī)引物法。用這兩種方法標(biāo)記好的探針大小在200一500bp范圍內(nèi),是用于雜交的最佳大小。另外,也可以在已知順序的兩個(gè)引物之間用PCR法來擴(kuò)增,或從合適的載體上通過RNA轉(zhuǎn)錄而來。1.2探針和染色體的雜交染色體原位雜交:標(biāo)記后的探針經(jīng)變性后.加于變性的中期染色體分裂相標(biāo)本上。于37攝氏度、50%的甲酰胺2XSSC條件下進(jìn)行雜
5、交.最適的雜交條件主要取決于探針與靶基因的性質(zhì)。對(duì)于單拷貝基因的雜交,特別是較長的來自基因組的序列,一般在雜交之前應(yīng)進(jìn)行預(yù)復(fù)性過程,標(biāo)記的探針與過量的基因組DNA或Cot-1重復(fù)序列一起孵育1小時(shí),使探針中非特異的重復(fù)序列被封閉。從而抑制該部分探針與染色體之間發(fā)生非特異性雜交,上述過程又稱為抑制性染色體原位雜交。經(jīng)預(yù)復(fù)性之后已標(biāo)記好的變性探針(200一500bP)再與變性的染色體在含有甲酰胺,鹽和醋酸葡聚糖的雜交緩沖液中雜交過夜。接著是柔和的洗滌,以去除未雜交或錯(cuò)配對(duì)的探針。1.3信號(hào)的檢測(cè)在洗去未雜交和錯(cuò)配對(duì)的探針分子之后,載片培養(yǎng)在免疫熒光試劑中,使其在探針
6、雜交的位置上產(chǎn)生熒光信號(hào),偶聯(lián)了熒光素分子的抗生物素蛋白被用來標(biāo)記已摻入到探針分子中的生物素、地谷新、二硝基苯、AFF和磺酸鹽則可以用相應(yīng)的標(biāo)上了熒光素的抗免疫球蛋白來標(biāo)記。最常用的熒光素分子有FITC,rhodamine和TexasRed等。1.4分帶和信號(hào)定位染色體的分帶可以在雜交前,也可以在雜交后,高分辨的染色體標(biāo)本是取得好的帶形的基礎(chǔ)。常用的分帶方法有:G(Giemsa)帶、Q(Quinacrine)帶、R(Reverse)帶,包括色霉素chromomycinA3/偏端霉素distamycinA法;hoechst33258/propidiumiodide
7、[3,8—二氨基—5—[3—(二乙基-甲基氨)丙基]6-苯菲碘]法,DAPI[DAPI:4,6—diamidino,2—phenylindole2HCl]/propidiumiodide法,染色體的分帶也可以直接用AluLIHs(LIhomosapiens)或Alu之間的順序和染色體雜交而得到類似R帶的條帶,更多的人在努力使雜交信號(hào)和分帶可以同時(shí)在顯微鏡下看到。由于雜交和分帶同時(shí)進(jìn)行效果不佳,有人采用FL(fractionallength)來測(cè)量。以雜交信號(hào)相對(duì)于某固定位置(如端粒)的長度占該染色體長度的比例來表示。在不分帶的情況下,特定的染色體可以通過著絲粒特
8、異,或端粒特異的探針進(jìn)行