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《幾種酶的測(cè)定方法》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫(kù)。
1、4.3測(cè)定指標(biāo)及方法4.3.1芽長(zhǎng)、根長(zhǎng)、發(fā)芽率及生根率選取發(fā)芽的種子測(cè)量芽長(zhǎng)和根長(zhǎng)，取平均值。發(fā)芽率:發(fā)芽率（%）=n/N*100(n為發(fā)芽種子數(shù)，N為供試種子總數(shù)）。4.3.2淀粉酶測(cè)定采用3，5-二硝基水楊酸法測(cè)定540nm處麥芽糖的吸光度變化來(lái)得出淀粉酶活力[119]。1）、稱取1g小麥在研缽里研磨（加入數(shù)克石英砂），再加入4ml1%氯化鈉溶液，再用1%氯化鈉溶液洗凈該研磨物洗入10ml離心管里，在3000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速中離心10分鐘。再將上清液倒入100ml容量瓶，再用磷酸緩沖溶液定容，即可制備各培養(yǎng)皿的酶溶液。2）
2、、取酶溶液0.5ml放入試管中,置于40攝氏度恒溫保溫15分鐘，再加入40攝氏度預(yù)熱的1%淀粉溶液2ml,保溫5分鐘，取出后向各試管加入4ml0.4mol/L氫氧化鈉溶液，振蕩均勻后再加2mlDNS試劑。3）、將各試管置沸水煮沸5分鐘，加蒸餾水定容至20ml。4）、最后，用可見(jiàn)分光光度計(jì)在540nm下測(cè)定各試管的吸光值，從而計(jì)算出各試管的酶活量。4.3.3丙二醛含量的測(cè)定于532nm和600nm波長(zhǎng)下測(cè)定光密度，計(jì)算丙二醛含量[120]。（1）酶液提取稱取蘿卜葉片lg放入研缽，加少許pH7.0的磷酸緩沖液和石英砂，研磨成勻漿，
3、移人50ml容量定容。再?gòu)钠渲腥〕鲆徊糠蛛x心，上清液即為酶液備用。吸取3ml酶提取液放入刻度試管中，加入5ml0.5%硫代巴比妥酸的5%三氯乙酸溶液，在沸水浴上加熱10分鐘，迅速冷卻，以4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘。取上清液在532nm和600nm波長(zhǎng)下，測(cè)定光密度（以不加酶液的對(duì)照調(diào)零）（2）結(jié)果計(jì)算A—反應(yīng)液總量（4ml）；V—提取液總量(5mL)；a—測(cè)定用提取液量(1.5mL)；W—植物樣品重量(g)；1.55×10-1—丙二醛μmol·l-1的消光系數(shù)。）4.3.4脯氨酸的測(cè)定在酸性條件下，茚三酮和脯氨酸反應(yīng)產(chǎn)生穩(wěn)定的
4、紅色產(chǎn)物，該物質(zhì)的最大吸收峰是520nm，脯氨酸含量用酸性茚三酮法測(cè)定[121]。（1）繪制脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，配制脯氨酸溶度為l00μg/ml的母液。取母液0.0、0.5、1.25、2.5、5.0、12.5、10.0ml分別放入7個(gè)50m1容量瓶中，再分別加入蒸餾水定容至50ml，配成0.0、1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0ug/ml的溶液。分別取上述各溶液2ml，加入已編號(hào)的7個(gè)試管中，再分別加入2ml酸性茚三酮試劑、1ml冰醋酸、1ml3％磺基水楊酸溶液；搖勻之后，在沸水浴中顯色30分鐘，取出后冷卻至室溫
5、，向各管加入2ml甲苯，充分振蕩，以萃取紅色產(chǎn)物。萃取后靜置，使紅色物質(zhì)轉(zhuǎn)入甲苯層；用滴管輕輕吸取紅色的溶液于比色杯中，在分光光度計(jì)520nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光率；以脯氨酸含量和吸光率繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。（2）游離脯氨酸的提?。悍Q取0.1～0.5g小麥，剪碎后放人具塞試管中，加5m13％磺基水楊酸溶液，加塞后在沸水浴中提取10分鐘，過(guò)濾液待測(cè)，也可直接吸取提取清液測(cè)定。（3）游離脯氨酸曲測(cè)定取提取液2mI于具塞試管中,加入1ml水、1ml冰醋酸和2ml酸性茚三酮試劑，搖勻后在沸水浴中加熱顯色30分鐘，取出后冷卻至室溫，加入2ml甲苯，充
6、分振蕩，以萃取紅色產(chǎn)物。再靜置使其分層，待完全分層后，吸取甲苯層，于分光光度計(jì)520nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光率。（4）計(jì)算樣品中脯氨酸的含量C—由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得脯氨酸μg數(shù)；V—提取液總體積（ml）；a—測(cè)定液體積（ml）；W—樣品重（g）4.3.5過(guò)氧化物酶活性的測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定過(guò)氧化氫酶（POD）活性[122]。（1）酶液提?。喝⌒←?g，剪碎置于研缽中，加5mL0.1mol/LTris-HCl緩沖液（pH8.5），研磨成勻漿，以4000rpm離心5min，傾出上清液，必要時(shí)殘?jiān)儆?mL緩沖液提取一次，合并兩次上清液，保存
7、在冰箱（或冷處）備用。（2）取光徑1cm比色杯2個(gè)，向其中之一加入上述酶液150ul（如酶活性過(guò)高可稀釋之），再加入2ml0.2mol/L磷酸緩沖液（pH6.0）0.5ml0.75%H2O2,0.5ml0.25%愈創(chuàng)木酚，立即開(kāi)啟秒表記錄時(shí)間；而向另一比色杯中加入0.2mol/L磷酸緩沖液（pH6.0），作為零對(duì)照。用分光光度計(jì)在470nm波長(zhǎng)下測(cè)定反應(yīng)5min時(shí)的光密度值。（3）結(jié)果計(jì)算以每分鐘光密度變化（以每分鐘OD470nm變化0.01為1個(gè)活力單位）表示酶活性大小，即：過(guò)氧化物酶活力=·Vt/(0.01·W·Vs·t)
8、：反應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光度之變化Vt：提取液總體積W：葉片質(zhì)量t：反應(yīng)時(shí)間Vs：測(cè)定時(shí)用酶液體積4.3.6過(guò)氧化氫酶活性的測(cè)定在pH7.7條件下，從樣品中提取過(guò)氧化氫酶，在提取液中加入一定量的過(guò)氧化氫，使過(guò)氧化氫在過(guò)氧化氫酶作用下分解，再用1.0mol/L高錳酸鉀溶液滴定過(guò)量的過(guò)氧化
