幾種MIC的測定 方法

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1、幾種測定抗菌藥物最低抑菌濃度（MIC）的方法1濁度法1.1常量肉湯稀釋法?（試管）1.1.1.抗菌藥物貯存液制備?將抗菌肽稀釋到無菌水中，制成1024μg/ml的原液，（也可以用0.22um濾膜進(jìn)行過濾，但要去掉前面5ml的過濾抗菌肽溶液）。抗菌藥物貯存液濃度按照不同梯度稀釋。1.1.2.藥敏試驗(yàn)用抗菌藥物濃度范圍根據(jù)抗菌藥物敏感性試驗(yàn)操作標(biāo)準(zhǔn)，藥物濃度范圍應(yīng)包含耐藥、中介和敏感分界點(diǎn)值，特殊情況例外。?1.1.3.?培養(yǎng)基?推薦使用LB肉湯培養(yǎng)基，pH7.0~7.4。指示菌為大腸桿菌或沙門氏菌。?1.1.4.接種物的制備?有2種方法配制接種物，一是細(xì)菌生

2、長方法，用接種環(huán)挑取形態(tài)相似待檢菌落3-5個(gè)，接種于4-5ml的LB肉湯中，35℃孵育2-6h。增菌后的對(duì)數(shù)生長期菌液用生理鹽水或LB肉湯培養(yǎng)基校正濃度至0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)，約含1~2×108CFU/ml。二是直接菌落懸液配制法，推薦直接取培養(yǎng)18~24h的菌落調(diào)配成0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)的菌懸液。用LB肉湯將上述菌懸液進(jìn)行1∶100稀釋后備用。注意應(yīng)在15分鐘內(nèi)接種完配制好的接種物，并取一份接種物在非選擇性瓊脂平板上傳代培養(yǎng)，以檢查接種物純度。?1.1.5.稀釋抗菌藥物的制備及菌液接種?取無菌試管（13×100mm）13支，排成一排，除第1管加入1.6mlL

3、B肉湯外，其余每管加入LB肉湯1ml，在第1管加入抗菌藥物原液（如1024μg/ml）?0.4ml混勻，然后吸取1ml至第2管，混勻后再吸取1ml至第3管，如此連續(xù)倍比稀釋至第11管，并從第11管中吸取1ml棄去，第12管為不含藥物的生長對(duì)照。此時(shí)各管藥物濃度依次為256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25μg/ml。然后在每管內(nèi)加入上述制備好的接種物各1ml，使每管最終菌液濃度約為5×105CFU/ml。第1管至第11管藥物濃度分別為128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125μg/ml。?（注：在稀釋的

4、過程中，每次吸取1ml到下一管中后，要換掉槍頭，后面的方法相同）1.1.6.孵育?將接種好的稀釋管塞好塞子，置37℃搖床培養(yǎng)16~20h。?1.1.7.結(jié)果判斷與解釋?在讀取和報(bào)告所測試菌株的MIC前，應(yīng)檢查生長對(duì)照管的細(xì)菌生長情況是否良好，同時(shí)還應(yīng)檢查接種物的傳代培養(yǎng)情況以確定其是否污染，質(zhì)控菌株的MIC值是否處于質(zhì)控范圍。以肉眼觀察，藥物最低濃度管無細(xì)菌生長者，即為受試菌的MIC。或者用分光光度計(jì)測定OD600，與未接菌的比對(duì)，判斷耐藥（resistant,?R）、敏感(susceptible,?S)或中介（intermediate,?I）。1.2.微

5、量肉湯稀釋法??（酶標(biāo)板）1.2.1.抗菌藥物和培養(yǎng)基制備?同常量肉湯稀釋法。?1.2.2.MIC板制備?無菌操作，將倍比稀釋后不同濃度的抗菌藥物溶液分別加到滅菌的96孔聚苯乙烯板中，第1至第11孔加藥液，每孔10μl，藥物濃度分別為1280、640、320、160、80、40、20、10、5、2.5、1.25μg/ml。?第12孔不加藥作為生長對(duì)照，如果當(dāng)時(shí)不使用，則冰凍干燥后密封，-20℃以下保存?zhèn)溆谩?1.2.3.接種物制備?將用生長法或直接菌懸液法制備的濃度相當(dāng)于0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)的菌懸液，經(jīng)LB肉湯1∶1000稀釋后，向每孔中加90μl，密封后置

6、37℃搖床孵育16~20h判斷結(jié)果。此時(shí)，第1孔至第11孔藥物濃度分別為128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125μg/ml。?1.2.4.結(jié)果判斷?以在小孔內(nèi)完全抑制細(xì)菌生長的最低藥物濃度為MIC（用酶標(biāo)儀測得OD600）。當(dāng)陽性對(duì)照孔（即不含抗菌肽）內(nèi)細(xì)菌明顯生長試驗(yàn)才有意義。當(dāng)在微量肉湯稀釋法出現(xiàn)單一的跳孔時(shí)，應(yīng)記錄抑制細(xì)菌生長的最高藥物濃度。如出現(xiàn)多處跳孔，則不應(yīng)報(bào)告結(jié)果，需重復(fù)試驗(yàn)。通常對(duì)革蘭陰性桿菌而言，微量肉湯稀釋法測得的MIC與常量肉湯稀釋法測得的結(jié)果相同或低一個(gè)稀釋度（1孔或2倍）。?2.瓊脂稀釋法?2.1瓊脂

7、稀釋法：瓊脂稀釋法是將不同劑量的抗菌肽藥物，加入融化并冷至50℃左右的定量MH或LB瓊脂中，制成含不同遞減濃度抗菌藥物的平板，接種受試菌，孵育后觀察細(xì)菌生長情況，以抑制細(xì)菌生長的瓊脂平板所含最低藥物濃度為MIC。本法優(yōu)點(diǎn)是可在一個(gè)平板上同時(shí)作多株菌MIC測定，結(jié)果可靠，易發(fā)現(xiàn)污染菌；缺點(diǎn)是制備含藥瓊脂平板費(fèi)時(shí)費(fèi)力。?2.1.1培養(yǎng)基和抗菌肽原液制備?使用LB瓊脂，pH7.2~7.4。按照倍比稀釋法，分別配制12800、6400、3200、1600、800、400、200、100、50、25、12.5ug/mL的抗菌肽原液（如采用90%的抗菌肽，可以從320

8、0ug/mL進(jìn)行稀釋）。2.1.2含抗菌肽瓊脂平板制備?將配制好的