發(fā)酵法產(chǎn)琥珀酸

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1、發(fā)酵法產(chǎn)琥珀酸琥珀酸,學(xué)名丁二酸,廣泛存在于動植物和微生物體內(nèi),是生物進行TCA循環(huán)的中間產(chǎn)物之一。它是一種重要的有機合成中間體,主要應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、生物降解塑料、表面活性劑、洗滌劑、綠色溶劑和動植物生長刺激物等領(lǐng)域。人們主要是利用化學(xué)合成的方法,從丁烷通過順式丁烯二酐生產(chǎn)琥珀酸。該方法以石油為原料,生產(chǎn)成本高,環(huán)境污染嚴重,從而限制了琥珀酸的廣泛應(yīng)用。因此,人們開始將目標轉(zhuǎn)向通過生物發(fā)酵法來生產(chǎn)琥珀酸。微生物發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸以可再生資源糖和二氧化碳等作為主要原料,不僅擺脫了對石油化工原料的依賴

2、,而且可以固定二氧化碳,減少溫室氣體,綠色環(huán)保,具有一定的環(huán)境效益。在眾多的琥珀酸生產(chǎn)菌中，目前研究最多的是琥珀酸放線桿菌(Actinobacillussuccinogenes),產(chǎn)琥珀酸曼氏桿菌(Mannheimiasucciniciproducens),產(chǎn)琥珀酸厭氧螺(Anaerobiospirillumsucciniciproducens)和大腸桿菌(Escherichiacoli)等。產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌可自然產(chǎn)生高濃度琥珀酸,但對高濃度葡萄糖和琥珀酸鹽耐受性較差,而且要求嚴格厭氧環(huán)境,營養(yǎng)

3、條件復(fù)雜,產(chǎn)物分離困難,生產(chǎn)成本較高,代謝途徑尚未完全清楚,并且具有引起人類菌血癥的潛在病毒性。產(chǎn)琥珀酸放線桿菌和產(chǎn)琥珀酸曼氏桿菌都屬于瘤胃細菌,與其它測序基因組相比,二者的基因組序列更為相似,有很多共同的代謝特征:如能利用葡萄糖、果糖、木糖等多種碳源;以甲酸、乙酸和琥珀酸為主要發(fā)酵產(chǎn)物。產(chǎn)琥珀酸放線桿菌能耐受高濃度的琥珀酸鹽和葡萄糖,是最具發(fā)展前景的琥珀酸生產(chǎn)菌之一,其突變株系130Z的琥珀酸產(chǎn)量可達110g/L,是迄今報道的琥珀酸產(chǎn)量最高的菌株。但產(chǎn)琥珀酸放線桿菌對營養(yǎng)條件要求較高,并且只能

4、在高CO2濃度的條件下才以琥珀酸為主要產(chǎn)物,這需要額外的供氣設(shè)備,增加生產(chǎn)成本。產(chǎn)琥珀酸曼氏桿菌雖然能以琥珀酸為主要發(fā)酵產(chǎn)物,但其琥珀酸產(chǎn)量和得率都相對較低,遺傳學(xué)研究工具發(fā)展不成熟,有待于進一步提高。谷氨酸棒桿菌是工業(yè)谷氨酸生產(chǎn)菌,有望以纖維素糖為原料發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸,而且具有成熟的遺傳學(xué)研究工具和豐富的背景知識,但對其產(chǎn)琥珀酸的研究起步較晚,一些有機酸產(chǎn)生途徑尚未了解清楚,琥珀酸濃度和生產(chǎn)率都相對較低,產(chǎn)物分離純化過程復(fù)雜,成本高。大腸桿菌是模式生物,可以產(chǎn)生微量的琥珀酸,但是培養(yǎng)條件相對簡單

5、,基因組序列已完全公布,遺傳背景和代謝途徑比較清楚,菌種篩選和代謝途徑改造比較容易,是研究琥珀酸代謝途徑和提高琥珀酸產(chǎn)量的理想微生物。產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌研究進展產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌是一種革蘭氏陰性嚴格厭氧菌，以葡萄糖、乳糖為碳源發(fā)酵主產(chǎn)物為琥珀酸和乙酸，同時生成少量的甲酸、乙醇、乳酸。產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌是通過EMP途徑生成磷酸烯醇式丙酮酸（PEP），再通過羧化途徑最終生成琥珀酸。CO2濃度可以調(diào)節(jié)PEP羧化激酶的表達，CO2濃度上升，胞內(nèi)PEP羧化激酶濃度上升CO2對琥珀酸發(fā)酵的影響與發(fā)酵液pH有關(guān)，通

6、入H2有利于琥珀酸的生成，對其它副產(chǎn)物生成沒有影響。產(chǎn)琥珀酸所用的CO2可以由Na2CO3(濃度1.5M)提供，此時通入CO2對產(chǎn)琥珀酸有負作用，對副產(chǎn)物乙酸的產(chǎn)生沒有影響。產(chǎn)琥珀酸放線桿菌研究進展產(chǎn)琥珀酸放線桿菌是一種革蘭氏陰性兼性厭氧瘤胃細菌。產(chǎn)琥珀酸放線桿菌可以利用多種碳源，并且可以在高濃度的琥珀酸條件下生長。產(chǎn)琥珀酸放線桿菌與產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌的琥珀酸發(fā)酵代謝途經(jīng)相同，是通過EMP途徑生成磷酸烯醇式丙酮酸（PEP），再通過羧化途徑最終生成琥珀酸。密西根生物技術(shù)研究中心（MBI）的Guett

7、ler等人以Actinobacillussuccinogenes130Z為出發(fā)菌株，篩選得到的自發(fā)突變株的琥珀酸產(chǎn)量可以達到80g/LGuettler等人對篩選得到的自發(fā)突變株的發(fā)酵條件做了初步的研究，實驗結(jié)果表明，該菌株可在高濃度的葡萄糖培養(yǎng)基中生長（150g/L），酵母抽提物、玉米漿有利于菌體生長和產(chǎn)酸，O2對菌體無毒害作用，在空氣中提高CO2分壓有利于菌體生長和產(chǎn)酸，菌體的最適生長和產(chǎn)酸pH為6.8。產(chǎn)琥珀酸大腸桿菌研究進展　厭氧條件下,大腸桿菌以糖或其衍生物為底物進行混合酸發(fā)酵,發(fā)酵產(chǎn)物

8、為甲酸、乙酸、乙醇、乳酸和琥珀酸等,其中琥珀酸得率較低,一般低于0.2mol/mol葡萄糖。大腸桿菌有兩種葡萄糖消耗方式,一是葡萄糖經(jīng)磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS)轉(zhuǎn)移和磷酸化,以磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)為輔助底物,1mol葡萄糖轉(zhuǎn)化生成1molPEP和1mol丙酮酸;二是葡萄糖借助半乳糖協(xié)同運輸系統(tǒng)的半乳糖滲透酶到達細胞體內(nèi),經(jīng)葡萄糖激酶磷酸化進入糖酵解途徑,1mol葡萄糖最終轉(zhuǎn)化為2molPEP。PEP可以被PEP羧化酶和丙酮酸激酶利用,PEP羧化酶催化PEP固定CO2,生成草酰乙酸進入C4途徑