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《DNA、RNA的提取、純化與鑒定》由會員上傳分享,免費在線閱讀,更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、DNA/RNA的提取、純化與鑒定編輯詞條發(fā)表評論(0)目錄DNA的提取純化基因組DNA的提取從植物組織提取基因組DNA從動物組織捉?取基因組DNA細菌基因組DNA的制備基因組DNA的檢測組織DNA的提取和純化石蠟包埋組織的DNA提取及其應(yīng)用外周血DNA提取技術(shù)真核細胞DNA的制備植物組織中DNA的提取細菌DNA的提取方法真菌DNA提取總結(jié)的兩種方法組織mRNA提取操作步驟RNA酶活性的控制用杲硫氤酸弧和有機溶劑提取RNAmRNA的分離哺乳動物細胞總RNA的分離植物總RNA的分離植物mRNA的分離PCR常
2、見問題分析瓊脂糖凝膠DNA回收常見問題分析RNA提取常見問題分析DNA電泳常見問題分析質(zhì)粒提収簾見問題分析凝膠電泳操作注意事項實驗:DNA片段的回收及純化實驗:RNA的提取及其純度檢測[顯示部分]DNA的提取純化編輯木段冋目錄一、細菌培養(yǎng)物的牛長從瓊脂平板上挑取一個單菌落,接種到培養(yǎng)物中(冇含冇行當(dāng)抗生索的液體培養(yǎng)慕中生長),然后從中純化質(zhì)粒,質(zhì)粒的捉純幾乎總是如此?,F(xiàn)在使用的許多質(zhì)粒載體(如pUC系列)都能復(fù)制到很高的拷貝數(shù),惟致只要將培養(yǎng)物放在標(biāo)準(zhǔn)LB培養(yǎng)基中生長到對數(shù)晚期,就可以大量提純質(zhì)粒。此時
3、,不必造反性地擴增質(zhì)粒DNAo然而,較長一代的載體(如pBR322)由于不能如此自由地復(fù)制,所以需要在得到部分生長的細菌培養(yǎng)物中加入氯霉索繼續(xù)培養(yǎng)若十小時,以便對質(zhì)粒進行性擴增。氯霉素可抑制宿主的蛋白質(zhì)合成,結(jié)果阻止了細菌染色體的復(fù)制,然而,松弛型質(zhì)粒仍可繼續(xù)復(fù)制,在若干小時內(nèi),其拷貝數(shù)持續(xù)遞增。這樣,像PBR322-類的質(zhì)粒,從經(jīng)氯霉索處理和未經(jīng)處理的培養(yǎng)物屮捉取質(zhì)粒的產(chǎn)量迥然不同,前者人為增高。多年來,加入足以完全抑制蛋口質(zhì)合成的氯霉素(pg/ml)Q成為標(biāo)準(zhǔn)的操作、用該方法提収的質(zhì)粒DNA量,對于
4、分子克隆中兒乎所有想象到的工作任務(wù)。二、細菌的收獲和裂解細菌的收獲口J通過離心來進行,而細菌的裂解則町以采川多種方法中的任意一種,這些方法包括用非離子型或離子型去污劑、有機溶劑或堿進行處理及用加熱處理等。選擇哪一種方法収決于3個因素:質(zhì)粒的大小、大腸桿菌菌株及裂解后用于純化質(zhì)粒DNA的技術(shù)。盡管針對質(zhì)粒和宿主的每一種組合分別提出楮確的裂解條件不切實際,但仍可據(jù)下述一般準(zhǔn)則來選擇適當(dāng)方法,以取得滿意的結(jié)果。1、大質(zhì)粒(大于15kb)容易受損,故應(yīng)采用漫和裂解法從細胞中釋放出來。將細菌懸于蔗糖等滲溶液中,然
5、后川溶菌酶和EDTA進生處理,破壞細胞壁和細胞外膜,再加入SDS-?類去污劑溶解球形體。這種方法最人限度地減小了從具有正壓的細菌內(nèi)部把質(zhì)粒釋放出來所需耍的作用力。2、可用更劇烈的方法來分離小質(zhì)粒。在加入EDTA后,冇時還在加入溶菌酶后讓細菌暴露于去污劑,通過煮沸或堿處理使之裂解。這些處理可破壞堿基配對,故可使宿主的線狀染色體DNA變性,但閉環(huán)質(zhì)粒DNA鏈由于處于拓撲纏繞狀態(tài)而不能彼此分開。當(dāng)條件恢復(fù)正常時,質(zhì)粒DNA鏈迅速得到準(zhǔn)確配置,重新形成完全大然的超螺旋分子。3、一些大腸桿菌菌株(如HB101的一
6、些變種衍生株)用去污劑或加熱裂解時可釋放相對大量的糖類,當(dāng)隨后用氯化錐一溟化乙錠梯度平衡離心進行質(zhì)粒純化時它們會惹出麻煩。糖類會在梯度中緊靠超螺旋質(zhì)粒DNA所占位置形成一致密的、模糊的區(qū)帶。因此很難避免質(zhì)粒DNA內(nèi)污染有糖類,而糖類可抑制多種限制酶的活性。故從諸如HB101和TG1等大腸桿菌菌株11?大量制備質(zhì)粒時,不宜使用煮沸法。4、當(dāng)從表達內(nèi)切核酸酚A的大腸桿菌菌株(endA+株,如HB101)中小量制備質(zhì)粒時,建議不使用煮沸法。因為煮沸不能完全滅活內(nèi)切核酸酶A,以后在溫育(如用限制酶消化)時,質(zhì)粒
7、DNA會被降解。但如果通過一個附加步驟(用酚:氯仿進行抽捉)可以避免此問題。5、忖前這一代質(zhì)粒的拷貝數(shù)都非常高,以致于不盂要用氯霉索進行選擇性擴增就可獲得高產(chǎn)。然而,某些工作者沿川氯霉素并不是要增加質(zhì)粒DNA的產(chǎn)量,而是要降低細菌細胞在用于大雖制備的溶液中所占體積。大量高度粘稠的濃縮細菌裂解物,處理起來煞為費事,而在對數(shù)屮期在增減物屮加入氯霉索可以避免這種現(xiàn)象。有氯霉索存在時從較少量細胞獲得的質(zhì)粒DNA的量以與不加氯霉素吋從較大量細胞所得到的質(zhì)粒DNA的量人致相等。三、質(zhì)粒DNA的純化常使用的所有純化方
8、法都利用了質(zhì)粒DNA相對較小及共價閉合壞狀這樣兩個性質(zhì)。例如,用氯化鈉一漠化乙錠梯度平衡離心分離質(zhì)粒和染色體DNA就取決于漠化乙錠與線狀以及與閉環(huán)DNA分子的結(jié)合量有所不同。浪化乙錠通過嵌入奮不顧身堿基之間而與DNA結(jié)合,進而使雙螺旋解旋。由此導(dǎo)致線狀DNA的長度有所增加,作為補償,將在閉環(huán)質(zhì)粒DNA屮引入超螺旋單位。最示,超螺旋度人為增加,從而阻止了漠化乙錠分了的繼續(xù)嵌入。但線狀分了不受此限,可繼續(xù)結(jié)合更多的染料,直至達到飽和(每2個堿棊