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《DNA和RNA的提取與純化》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。
1、第四章 基因工程的主要技術(shù)及其原理第一節(jié)DNA和RNA的提取與純化制備純的高分子量的DNA是基因工程操作的基礎(chǔ)之一一、DNA提取的基本原理與方法化學性質(zhì)比較穩(wěn)定潛在的反應(yīng)基團隱藏在中央螺旋內(nèi)，并經(jīng)氫鍵緊密連接。它的堿基對外側(cè)受磷酸和糖形成的強大環(huán)層的保護，這種保護因內(nèi)在的堿基堆積力而進一步加強。1.DNA的性質(zhì)：核苷核苷酸堿基高分子質(zhì)量DNA長而彎曲，僅具有極微的側(cè)向穩(wěn)定性，因而容易受到最柔和的流體剪切力的傷害。雙鏈DNA在溶液中隨機卷曲，并由于堿基堆積力和DNA骨架上磷酸基團間的靜電排斥力而變得黏滯。由吸液，振蕩，攪拌所導(dǎo)致的水流對黏滯的盤繞物產(chǎn)生拖拉力，能切斷DNA的雙鏈。DNA分子越長
2、，斷裂所需的力越弱。因此，基因組DNA容易成片段地獲得，所需分子質(zhì)量越大，獲得的難度也相應(yīng)增加。物理性質(zhì)2.天然DNA的來源和用途天然DNA包括染色體DNA,病毒DNA(噬菌體DNA),質(zhì)粒DNA,線粒體及葉綠體DNA等,可從不同的生物體中提取.染色體DNA.原核和真核生物均含有染色體DNA.其分子巨大,可長達106kb,小的也有1000kb左右.是生物界含量最豐富的DNA資源,蘊藏著地球上極大部分的遺傳信息.是分離目的基因和基因表達調(diào)控因子的主要材料,也可提供構(gòu)建染色體載體和染色體基因整合平臺系統(tǒng)之用.病毒和噬菌體DNA.含DNA的病毒和噬菌體的種類很多,能在相應(yīng)的原核生物和真核生物宿主細
3、胞內(nèi)大量增殖.由于此類DNA可被體外包裝,所以主要用于構(gòu)建基因克隆載體,承載較大片段的外源DNA,經(jīng)體外包裝,導(dǎo)入受體細胞.此類DNA也編碼一些結(jié)構(gòu)基因,可作為分離目的基因和基因表達調(diào)控因子的材料.質(zhì)粒DNA很多微生物細胞內(nèi)含有質(zhì)粒DNA,游離于細胞質(zhì)中,所以被稱為染色體外遺傳物質(zhì).每種質(zhì)粒都有復(fù)制起始位點,能自我復(fù)制.主要用于構(gòu)建載體.也要用于分離目的基因和基因表達調(diào)控因子.線粒體和葉綠體DNA.真核生物特有的染色體外遺傳物質(zhì),分別含有與呼吸作用和光合作用有關(guān)的基因.可用于分離目的基因及構(gòu)建載體不同生物（植物、動物、微生物）的基因組DNA的提取方法有所不同;不同種類或同一種類的不同組織因其
4、細胞結(jié)構(gòu)及所含的成分不同，分離方法也有差異。在提取某種特殊組織的DNA時必須參照文獻和經(jīng)驗建立相應(yīng)的提取方法，以獲得可用的DNA大分子。（一）DNA提取的基本原理DNA分子是極性分子，溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有機溶劑，其鈉鹽比游離太更易溶于水。酸性溶液中，DNA易水解，在中性或弱堿性溶液中較穩(wěn)定。生物細胞中大部分DNA集中在細胞核，多以脫氧核糖核蛋白(DNP)形式存在。而DNP在鹽溶液中的溶解度受鹽溶液濃度的顯著影響，0.14mol/LNaCl溶液中最低，僅為水中溶解度的1%，濃度升高，溶解度增加，到1mol/L時，比純水高2倍。而核糖核蛋白(RNP)在鹽溶液中的溶解度受鹽濃度的影響較小，
5、在0.14mol/LNaCl的溶解度較大。據(jù)此，可分享DNP和RNP.一般DNA提取都分為兩步，即先是溫和或機制裂解細胞及溶解DNA，接著采用幾種化學和酶學方法中的任一種，以去除蛋白、RNA及其它的大分子。1生物材料的準備選用的材料應(yīng)該是處于提取DNA得率最高的生長期,或者是DNA容易提取和含量高的組織.對于細菌,一般取對數(shù)生長后期.對于植物一般取幼嫩的植株,并且暗培養(yǎng)1-2天,甚至黃化苗.提取動物肝臟DNA應(yīng)清除膽囊,因其含有多種高活性酶.2細胞的裂解和DNA的溶解細胞不裂解,則DNA釋放不出來.裂解不完全,得率就低.如果細胞裂解過于激烈,會導(dǎo)致DNA的斷裂.裂解方法因物種而異.對于原核生
6、物,可用溶菌酶處理.用NaOH,SDS,用煮沸及冰凍,超聲波處理等方法使細胞裂解.對結(jié)構(gòu)復(fù)雜的動植物材料要進行磨樣(粉碎)。一般方法是將材料放入研缽（放在冰中預(yù)冷），加入液氮，快速磨碎成粉狀。然后再參照裂解原核生物細胞的方法裂解細胞.一般用SDS、CTAB、溶菌酶和蛋白酶K來裂解細胞。所用緩沖液一般為TE（TrisC-HClEDTA）緩沖液。提取緩沖液：100mmol/LTrisCl(pH8.0),50mmol/LEDTA(pH8.0),500mmol/LNaCl,10mmol/Lα巰基乙醇。在提取時，將10％SDS加入緩沖液中于65℃預(yù)熱一定時間。然后加入到裝有樣品的離心管中，于65℃保溫
7、60－90min。其間輕輕搖動數(shù)次。4℃下12000rpm離心10min,將上清轉(zhuǎn)入另一離心管中,上清即為DNA的粗提物。正常條件下，由于細胞的區(qū)室化隔離，DNA酶，氧化酶等分布于特定區(qū)隔中，不與DNA接觸。細胞破碎，則容易導(dǎo)致DAN降解。因此提取過程中對DNA的保護顯得非常重要。措施：（１）利用液氮超低溫下研磨，減少損失。（２）快速加入緩沖液并迅速混勻，對細胞溶漿中DNA進行保護。加入EDTA和抗氧化劑及P
