魚類轉(zhuǎn)基因新技術(shù)研究現(xiàn)狀

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1、文獻(xiàn)綜述魚類轉(zhuǎn)基因新技術(shù)研究現(xiàn)狀摘要：相對于哺乳動物，魚類更加易于轉(zhuǎn)基因研究，由于其懷卵量大，體外受精，體外發(fā)育，易于操作和觀察，易于培育和飼養(yǎng)，而成為研究轉(zhuǎn)基因動物的最佳人選動物，其潛在的利用價(jià)值使得眾多研究者熱衷于魚類轉(zhuǎn)基因研究。魚類轉(zhuǎn)基因技術(shù)經(jīng)過數(shù)十年的發(fā)展日漸成熟，并推動轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究進(jìn)入一個新的發(fā)展階段。文章綜述了精巢直接注射轉(zhuǎn)染精原干細(xì)胞法、轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移法、RNA干擾介導(dǎo)的基因敲除法、基因打靶法、胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法等近年發(fā)展起來的方法。文章在前人研究的基礎(chǔ)上重點(diǎn)總結(jié)了以上各種魚類轉(zhuǎn)基因技術(shù)的最新研究動態(tài)并對各種轉(zhuǎn)基因技術(shù)的特點(diǎn)進(jìn)行了探討。

2、關(guān)鍵詞：魚類，轉(zhuǎn)基因，SSCs,RNAi,基因打靶動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)是指運(yùn)用基因工程等實(shí)驗(yàn)技術(shù)手段，對動物基因組進(jìn)行有目的的遺傳修飾，并通過動物育種技術(shù)使修飾改造的基因穩(wěn)定遺傳給后代動物的一種牛物技術(shù)。血類是脊椎動物門中種類最多的一個類群，其懷卵量大，體外受精，體外發(fā)育，易于操作和觀察，易于培育和飼養(yǎng)，是發(fā)育生物學(xué)研究的良好試驗(yàn)動物。魚類乂是人類的重要蛋白質(zhì)來源，人們一直在尋求和培育生長快、餌料省、抗逆性強(qiáng)的養(yǎng)殖對彖，基因工程技術(shù)為這一目標(biāo)開辟了一條新的途徑1985年，朱作言等⑵將冠以小鼠重金屈螯合蛋口基因啟動與調(diào)控序列和人生長激素基因(GH),注射到鯽魚(C

3、arassiusauratus)的受精卵，培育出世界上第一批轉(zhuǎn)基因魚，并通過性腺傳遞給子代，建立了世界上首例轉(zhuǎn)基因魚模型。自此，國內(nèi)外己獲得20?30種轉(zhuǎn)基因魚，在促進(jìn)生長，提高魚類抗逆性、抗病性等方血取得了顯著成績。構(gòu)建轉(zhuǎn)基因魚首先是獲得目的基因，然厲進(jìn)行基因克隆，最后把外源基因?qū)胧荏w魚(受精卵)。有效地向受體魚導(dǎo)入外源棊因，是研制轉(zhuǎn)基因魚的關(guān)鍵步驟之一?，F(xiàn)階段常采川的轉(zhuǎn)基因魚制備方法⑴，主要有顯微注射法、精子載體法、反轉(zhuǎn)錄病毒感染法。近年來，隨著轉(zhuǎn)某因技術(shù)研究的繼續(xù)深入，出現(xiàn)了許多魚類轉(zhuǎn)基因新技術(shù)、新方法，現(xiàn)介紹如ho1.精巢直接注射轉(zhuǎn)染精原干細(xì)胞法

4、精原T細(xì)胞(Spermatogonialstemcells,SSCs)是精子形成的前體細(xì)胞，具有髙度自我更新能力和分化潛能，精原十細(xì)胞位于雄性尙類體內(nèi)曲細(xì)精管牛精上皮基膜內(nèi)，不僅能夠口我更新牛成新的干細(xì)胞，而且可以源源不斷的增殖分化形成各階段的牛殖細(xì)胞直至精子，從而向下一代傳遞遺傳信息⑷。通過魚類精巢體外分離培養(yǎng)獲得精原T細(xì)胞，再運(yùn)用合適的手段將外源基因?qū)刖杉?xì)胞中,根據(jù)魚類生殖系統(tǒng)特征⑸，經(jīng)共同通道泄殖孔逆向注射進(jìn)入適齡受體竹.的輸精管，經(jīng)過擴(kuò)散，進(jìn)入生精小管屮，進(jìn)而產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因精子，與雌性交配產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因魚。Samyra等⑹報(bào)道，以羅非魚為實(shí)驗(yàn)材料，分

5、離培養(yǎng)得到精原干細(xì)胞，用膜標(biāo)記熒光染料PKH26-GL標(biāo)記，通過精巢直接注射，最終得到含有標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因精子。此項(xiàng)技術(shù)為研究精了的發(fā)生以及轉(zhuǎn)基因動物的制作提供了一個極佳的思路，因?yàn)樵隗w外培養(yǎng)精原干細(xì)胞的過程中可以探索最佳的DNA轉(zhuǎn)染條件，又能夠?qū)D(zhuǎn)染外源基因的陽性精原干細(xì)胞進(jìn)行篩選，還避免了傳統(tǒng)體外孵育時(shí)，因精子存活時(shí)間限制和外源DNA附著于精子頭部等因素所導(dǎo)致精子活力下降和受精能力下降，從而大大提高了轉(zhuǎn)基因效率⑺。圖1?1性成熟羅非魚精原干細(xì)胞移植主要步驟(圖片來源文獻(xiàn)[6])Fig1?1Illustrationofthemainstepsutilized

6、forgermcelltransplantationinsexuallymaturetilapia(O.niloticus)2.轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)座了擁冇可以在基因組內(nèi)插入和切離并改變自身位置的特性，使Z能攜帶外源基因整合到動物基因組內(nèi)，從而制作轉(zhuǎn)基因動物⑻。以轉(zhuǎn)座酶或巨核酸酶I?SceI介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法。Fadool^[9]將mariner元件成功地轉(zhuǎn)入了斑馬魚中，極人提髙斑馬魚轉(zhuǎn)植基因的瞬時(shí)表達(dá)和穩(wěn)定性表達(dá)的效率，并實(shí)現(xiàn)了種系傳遞。青觸(Oryziaslatipes)Tol2轉(zhuǎn)座子是在脊椎動物上第一個發(fā)現(xiàn)的具天然活性的轉(zhuǎn)座子，轉(zhuǎn)基因鶴合率是傳統(tǒng)質(zhì)

7、粒的10倍【⑼。近年來利用Tol2介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)已成功獲得了多種轉(zhuǎn)基因斑馬俗，斑馬血pob基因的突變nJ引起紅光盲癥，Huang等冋利用Tol2轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)介導(dǎo)的增強(qiáng)子捕獲技術(shù)構(gòu)建得到了心肌特異性表達(dá)GFP蛋白的轉(zhuǎn)某因斑馬魚，且在心房和房室管屮觀察到了特異性表達(dá)的GFP。Hu等Z利用重組Tol2轉(zhuǎn)座子載體構(gòu)建轉(zhuǎn)基因斑馬魚受精卵，用于生產(chǎn)藥用蛋白(IGF-1,1GF-2),在轉(zhuǎn)基因斑馬魚受精卵中檢測到有IGF-1和IGF-2的可溶性表達(dá)。最近在金魚(Ccirassius如上也發(fā)現(xiàn)了具冇自主轉(zhuǎn)座活性的Tgf2轉(zhuǎn)座酶，這是第二個發(fā)現(xiàn)的冇天然轉(zhuǎn)座活性的脊推動物轉(zhuǎn)座

8、了，金魚Tgf2轉(zhuǎn)座子在我國不同金魚品系屮存在，其起源可能要早于青