樹突狀細(xì)胞疫苗在肝癌和腎癌免疫治療中的基礎(chǔ)與應(yīng)用研究

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1、中山大學(xué)博士學(xué)位論文樹突狀細(xì)胞疫苗在肝癌和腎癌免疫治療中的基礎(chǔ)與應(yīng)用研究姓名：周軍申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：腫瘤學(xué)指導(dǎo)教師：夏建川20090519中山人學(xué)博士學(xué)位論文樹突狀細(xì)胞疫苗在肝癌和腎癌免疫治療中的基礎(chǔ)與應(yīng)用研究樹突狀細(xì)胞疫苗在肝癌和腎癌免疫治療中的基礎(chǔ)與應(yīng)用研究專業(yè)：博士研究生：導(dǎo)師：腫瘤學(xué)周軍夏建川教授中文摘要第一部分肝癌相關(guān)重組腺相關(guān)病毒載體的構(gòu)建及在肝癌樹突狀細(xì)胞疫苗免疫治療研究中的應(yīng)用目的利用攜帶甲胎蛋白(Q．fetoprotein，AFP)基因的重組腺相關(guān)病毒(recombinantadeno．a(chǎn)ssociatedvirus，rAAV)轉(zhuǎn)染樹突狀

2、細(xì)胞(dendriticcell，DC)體外誘導(dǎo)抗肝癌免疫應(yīng)答。并通過構(gòu)建肝癌細(xì)胞特異性rAAV，將IFN-),基因?qū)敫伟┘?xì)胞進(jìn)一步增強(qiáng)rAAV／AFP．DC疫苗誘導(dǎo)的抗肝癌免疫應(yīng)答。方法1．?dāng)y帶IFN吖基因的肝癌細(xì)胞特異性rAAV(rAAV／IFN吖)的構(gòu)建：PCR擴(kuò)增甲胎蛋白啟動子(AFPpromoter，AFPp)、白蛋白啟動子(Albuminpromoter，ALBp)和巨細(xì)胞病毒增強(qiáng)子(cytomegalovirusenhancer，CMVe)、lB-actin增強(qiáng)子(p．a(chǎn)ctinenhancer，De)，并按不同的組合插入到rAAV載體中。將含有

3、不同啟動子和增強(qiáng)子的rAAV分別轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞株HepG2和Hep3B，篩選出表達(dá)活性最強(qiáng)的rAAV。利用篩選出的rAAV轉(zhuǎn)染其他非肝癌細(xì)胞株，驗證rAAV的肝癌組織特異性。將IFN吖基因插入到肝癌細(xì)胞特異性rAAV載體中，利用中山大學(xué)博一i：學(xué)位論文樹突狀細(xì)胞疫苗在肝癌和腎癌免疫治療中的基礎(chǔ)與應(yīng)用研究rAAWFN吖轉(zhuǎn)染HepG2和Hep3B，檢測IFN吖的表達(dá)水平及對HLA-class1分子表達(dá)的影響。2．rAAV／AFP．DC體外誘導(dǎo)抗肝癌免疫應(yīng)答：利用rAAV／AFP轉(zhuǎn)染來源于HLA．A2陽性健康志愿者的DC制備肝癌疫苗，檢測rAAV／AFP．DC疫苗的表型

4、、AFP表達(dá)及細(xì)胞因子分泌。rAAV／AFP．DC疫苗體外刺激自體T淋巴細(xì)胞，觀察對T細(xì)胞亞群和細(xì)胞因子分泌的影響。細(xì)胞毒實驗檢測并比較活化的T細(xì)胞對肝癌細(xì)胞株和rAAV／IFN吖轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞株的殺傷作用。結(jié)果1．結(jié)果表明rAAV／ALBp在Hep3B中表達(dá)活性最強(qiáng)，而rAAV／CMVeAFPp在HepG2中的表達(dá)活性最強(qiáng)，并且這兩種病毒在其他所有檢測的非肝癌細(xì)胞株中均沒有表達(dá)活性。rAAV／ALBp／IFN-1,和rAAV／CMVeAFPp／IFN-丫分別轉(zhuǎn)染Hep3B和HepG2后，兩種細(xì)胞均能有效表達(dá)IFN吖，并且HLA-class1分子表達(dá)水平顯著上調(diào)。

5、2．rAAV／AFP—DC能夠有效表達(dá)AFP，表面分子CD80、CD83、CD86、CD40、HLA．DR、CDIa表達(dá)上調(diào)，并大量分泌IL．12。rAAWAFP．DC疫苗體外刺激自體T淋巴細(xì)胞大量增殖，檢測發(fā)現(xiàn)增殖的T細(xì)胞主要為CD8+CD69+活化的殺傷性T細(xì)胞(cytotoxicTlymphocyte，CTL)，而CD4+CD25+的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulativeTcell，Treg)則較少，并且活化的T細(xì)胞大量分泌IFN—Y，而不分泌IL一4。CTL對Hep3B和HepG2均有不同程度的殺傷作用，并且rAAV／IFN吖轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞后，CTL對肝癌細(xì)胞

6、的殺傷作用增強(qiáng)。結(jié)論篩選出的兩種肝癌細(xì)胞特異性rAAV具有相對的肝癌組織特異性，為肝癌的治療提供了一種靶向性的載體工具。rAAV／AFP—DC疫苗體外能夠誘導(dǎo)出有效的抗肝癌免疫應(yīng)答。rAAV／IFN吖轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞后，能夠增強(qiáng)CTL對肝癌細(xì)胞的殺傷作用，從而建立了一種增強(qiáng)DC疫苗誘導(dǎo)的抗肝癌免疫應(yīng)答的新方法，為研究出更有效、更特異的抗肝癌免疫療法奠定了基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：重組腺相關(guān)病毒；甲胎蛋白；樹突細(xì)胞；肝腫瘤；腫瘤免疫；丫干擾素一II—中山大學(xué)博=I：學(xué)位論文樹突狀細(xì)胞疫苗在肝癌和腎癌免疫治療中的基礎(chǔ)與應(yīng)用研究第二部分病人腫瘤組織來源腎癌細(xì)胞與異體樹突狀細(xì)胞融合疫苗

7、誘導(dǎo)抗腫瘤免疫：體外實驗結(jié)果與臨床反應(yīng)目的腎細(xì)胞癌(renalcellcarcinoma,RCC)已經(jīng)被證明對免疫治療比較敏感，本研究旨在探討病人腫瘤組織來源腎癌細(xì)胞與異體樹突狀細(xì)胞(dendriticcells，DC)融合疫苗誘導(dǎo)抗腎癌免疫反應(yīng)。方法將10例HLA—A2陽性腎癌病人的原代腎癌細(xì)胞與來源于HLA．A2陽性健康志愿者的DC融合。通過流式細(xì)胞儀和共聚焦顯微鏡檢測融合細(xì)胞的表型。在體外實驗中，用異體DC／RCC融合細(xì)胞刺激自體T淋巴細(xì)胞，檢測T細(xì)胞的增殖、IFN吖分泌及殺傷性T細(xì)胞(cytotoxicTlymphocytes，CTL)活性。在臨床試驗中

8、，10例病人分別免疫接種