表達(dá)基因克隆技術(shù)與圖譜構(gòu)建策略研究

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1、第五章表達(dá)基因克隆技術(shù)與圖譜構(gòu)建策略研究人類基因組計(jì)劃的主要任務(wù)之一就是要從人片段基因組區(qū)域或整條染色體DNA上鑒定出基因表達(dá)序列(geneexpressedsequences)或轉(zhuǎn)錄單位(transcriptionunits)□在人類基因組30億個(gè)堿基對(duì)屮，發(fā)生轉(zhuǎn)錄的表達(dá)序列(即基因)僅占總序列的3?5%。基因組屮絕大部分是基因間隔序列(intergenicseguences)或內(nèi)含子(intron)和各種各樣的巫復(fù)序列。測(cè)定基因表達(dá)序列可直接鑒別人類目而認(rèn)定的6?1()萬(wàn)(或僅3?5萬(wàn))個(gè)基因在染色體上的位置和排列順序，這就是人類基因組計(jì)劃所要構(gòu)建的第四張圖譜——基因

2、表達(dá)圖譜，乂稱基因轉(zhuǎn)錄圖譜(geneexpressionmapsorgenetranscriptionmaps)?；虮磉_(dá)圖譜是指細(xì)胞內(nèi)所有染色體上表達(dá)基因的排列和分布，即指細(xì)胞中所^mRNAoH前，人們把很人精力投入到基因表達(dá)圖譜的研究上，原因是表達(dá)基因序列是通過(guò)DNA序列的轉(zhuǎn)錄木一mRNA反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)DNA(complementaryDNA,cDXA)獲得的，即DNA外顯子序列轉(zhuǎn)錄后形成RNA,經(jīng)過(guò)剪切形成mRNAZ后，再將mRNA連接成模板，合成cDNA。因此，cDNA基因不包含非轉(zhuǎn)錄的內(nèi)含子序列，這大大減少了測(cè)序的工作量，加快了測(cè)序進(jìn)度，并可以有H的的直接針對(duì)某種

3、功能基因尤其是致病基因進(jìn)行測(cè)序、克隆和鑒泄。I大I此,表達(dá)棊因圖譜町作為致病基因診斷、克隆和基因治療的工具，幫助科學(xué)家鑒定能指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成和引發(fā)疾病的DNA片段，在此基礎(chǔ)上，針對(duì)疾病基因靶位進(jìn)行藥物設(shè)計(jì)?？梢?jiàn)，表達(dá)基因圖譜在醫(yī)學(xué)和制菊上有重要的應(yīng)用價(jià)值。構(gòu)建表達(dá)基因圖譜的前提條件是獲得大量的基因轉(zhuǎn)錄本mRM序列(cDM),該部分序列經(jīng)轉(zhuǎn)錄、翻譯片可直接作為基因表達(dá)出來(lái)，所以，對(duì)cDNA的測(cè)序就是尋找基因的表達(dá)序列。在人類基因組測(cè)序工作中，“cDNA測(cè)序戰(zhàn)略”是只測(cè)定轉(zhuǎn)錄的DNAJP列，而不是從“全基因組戰(zhàn)略”的角度對(duì)所有堿基的排序進(jìn)行測(cè)定。具有基因表達(dá)功能的cDNA乂稱表

4、達(dá)序列標(biāo)簽(expressedsequencetag,EST),特定的EST序列冇時(shí)可代表特定的cDNA。實(shí)施此戰(zhàn)略需從cDNA文庫(kù)中獲得一些長(zhǎng)為300?400個(gè)堿基序列的EST,英作用相當(dāng)于全基因組測(cè)序時(shí)的序列標(biāo)泄位點(diǎn)STS。1990年，人類基因組計(jì)劃提出了人規(guī)模cDNA測(cè)序戰(zhàn)略，并建立了表達(dá)序列標(biāo)簽EST測(cè)泄技術(shù)。KHS3U第一節(jié)表達(dá)基因的克隆策略80年代，科學(xué)家們?cè)噲D通過(guò)分析基因產(chǎn)物一RNA或蛋白質(zhì)獲得各種組織尤其是疾病的表達(dá)基因，從而繞過(guò)連鎖分析、圖譜構(gòu)建和DNA測(cè)序，直接找到表型與基因的相互關(guān)系。然而，事實(shí)證明,單純依靠表型特征無(wú)法確定致病基因的具體位置和相關(guān)

5、功能，更難以確泄疾病與基因的巴接對(duì)應(yīng)關(guān)系。隨著疾病研究手段的不斷發(fā)展和人類各種圖譜的構(gòu)建，以標(biāo)記位點(diǎn)為基本研究工具的基因克隆使人類研究表型與基因的相互關(guān)系成為可能?；蚩寺?genecloning)是指從基因組或DNA大片段屮分離并獲得某一特定的基因或DNA序列，再通過(guò)DNA序列擴(kuò)增形成由眾多拷貝組成的一個(gè)DA片段群體的過(guò)程。目前，廣泛應(yīng)用于致病基因分離與克隆的策略可歸納為位置克隆(positionalcloning)>候選位置克隆(candidatepositionalcloning)>表型克隆(phenotypiccloning)等。一、定位克隆定位克隆的總體思路是

6、疾病——染色體定位——基因序列——mRNA/cDNA——蛋白質(zhì)(致病基因產(chǎn)物)。定位克隆是通過(guò)分析患病家系的連鎖關(guān)系確定致病基因的遺傳方式，從染色體畸變引發(fā)的疾病入手，將染色體畸變的位置作為疾病基因克隆的一個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行分析的一種克隆策略，這種策略在基因組內(nèi)尚無(wú)足夠多態(tài)性位點(diǎn)提供某一疾病的連鎖信息時(shí)，不失為一?種有效的致病基因克隆策略。因此，利用染色體畸變克隆致病基因是早期研究致病基因的一種重要手段Z-o隨著人類基因紐遺傳圖譜和物理圖譜的完成，人們可冇效地利用圖譜標(biāo)記確定與疾病性狀的連鎖關(guān)系，并獲得這一區(qū)域的功能群，進(jìn)行基因泄位克隆。所以，泄位主耍集屮在從重疊的克隆群屮篩選表

7、達(dá)序列，從定位的染色體區(qū)段內(nèi)分離所要克隆的基因，經(jīng)擴(kuò)增后進(jìn)一步研究其功能。二、定位候選克隆定位候選克隆是定位克隆的-種改進(jìn)方法，是冃前被認(rèn)為最有發(fā)展前途的基因定位策略。人類基因組草圖問(wèn)tttZ后，所有人類致病基因?qū)⒑芸毂涣⑽辉谌旧w的某個(gè)區(qū)域，這樣，可從某局部的序列片段中篩選出致病基因進(jìn)行結(jié)構(gòu)與功能分析，這就是定位候選克隆。此法是將圖譜的一系列標(biāo)記與連鎖分析相結(jié)合，把與遺傳病有關(guān)的基因定位到圖譜的某一區(qū)域然后，利用己有數(shù)據(jù)查找到定位于此區(qū)域的所有己克隆的基因或cDNA,快速篩選染色體上與致病基因相關(guān)的可能位置，從中克隆出相關(guān)的