差異表達(dá)基因克隆技術(shù)的研究進(jìn)展.doc

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1、差異表達(dá)基因克隆技術(shù)的研究進(jìn)展提要：分離并克隆差異表達(dá)基因是目前功能性基因研究的熱點(diǎn)。mRNA差異展示是篩選差異表達(dá)基因最有效的技術(shù)Z—，它的主要不足是有一淀假陽性。RDA、SSH、DSD、LSH技術(shù)能夠克服假陽性，但也具有一定的不足，應(yīng)根據(jù)需要選擇運(yùn)用。隨看能擴(kuò)增長(zhǎng)片段及具有自動(dòng)校正功能的Taq酶出現(xiàn)及應(yīng)用，這些技術(shù)將會(huì)不斷完善與發(fā)展，具有廣闊的應(yīng)用前景。關(guān)鍵詞：弟異表達(dá)基因；克隆“一石激起T重浪”，用來形容“多莉”綿羊的問世在人們心中的各種反應(yīng)莫是一點(diǎn)都不過分，在生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展過程屮，無論是試管嬰兒、人工授精，還是體外授精、代理母親等一系列生殖技術(shù)的成果在世界上引起的反應(yīng)

2、，也許都稍遜于“克隆”。試管嬰兒也好，體外授精也好，代理母親也好，生命的產(chǎn)生畢竟還是基于精了和卵了的結(jié)合，這是人們可以琪慰的；而“多莉”是通過“無性繁殖”技術(shù)獲得的，這種在低級(jí)生物屮相當(dāng)普遍、而在高等動(dòng)物屮只是幻想的“無性繁殖”瞬間就擺在了人們眼前?，F(xiàn)代分子生物學(xué)研究表明，人類基因組約由10萬左右的不同基因組成，這些基因選擇性的表達(dá)決定了機(jī)體敕個(gè)生命過程，基因表達(dá)的變化處于控制生物學(xué)調(diào)節(jié)機(jī)制的屮心位置。因此，分離并克隆差異表達(dá)基因不僅有助于闡明生命的粵秘，而且還能為基因診斷與治療提供重要的理論依據(jù)。近幾年來，差異表達(dá)基因克隆技術(shù)不斷完善與發(fā)展，已成為研究腫瘤和疾病等相關(guān)基因的重耍手段。

3、高等真核生物的基因組一般具有80000?100000個(gè)基因，而每一個(gè)細(xì)胞大約只表達(dá)其屮的15%[1]。基因在不同細(xì)胞間及不同生長(zhǎng)階段的選擇性表達(dá)決定了生命活動(dòng)的多樣性，如發(fā)冇與分化、衰老與死亡、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、細(xì)胞周期調(diào)控等。比較細(xì)胞問基因表達(dá)的差異為我們揭示生命活動(dòng)的提供了依據(jù)。一、mRNA差異展示mRNA并異展示(mRNAdifferentialdisplayzDDRT-PCR)是目前篩選羌異表達(dá)基因最有效的方法之一，其基木原理是：3'端采用錨定引物，與mRNA3zpolya結(jié)合，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，形成mRNA：cDNA雜交分子，5'端采用20條隨機(jī)引物，與錨定引物一起進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其產(chǎn)物

4、經(jīng)測(cè)序膠顯示出來，再冋收鑒定克隆茅異條帶。1992年Liang和Pardee[l]建立此技術(shù)時(shí)，5'端采用20條隨機(jī)引物，每條由10個(gè)堿基組成，3’端采用12條引物即T12MN(M=A.C或G,N=A、G、C、T)o這種組合從統(tǒng)計(jì)學(xué)上幾乎能完全覆蓋所有的mRNA序列，并異表達(dá)的基因會(huì)全部呈現(xiàn)出來。實(shí)踐證明，這種方法有效，但假陽性率在50%?70%左右，差異條帶在Northern印跡上重現(xiàn)性羌，后續(xù)處理也比較復(fù)雜。1994年Ito[2]等對(duì)3"端引物進(jìn)行了改進(jìn),把12條引物改為3條,即T12A、T12C、T12G,使得實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)化。1995年Ayala[3]^提出了在3'端錨定引物與5'

5、端隨機(jī)引物上皆增加10個(gè)堿基，使得上下游引物Tm值在60°C左右，PCR循環(huán)參數(shù)也改為前5個(gè)循環(huán)采用Liang和Pardee推薦的參數(shù),即94°C30s,40°C2min,72°C30s。經(jīng)這樣改進(jìn),顯著地增強(qiáng)了弟異條帶的重復(fù)性和敏感性，同時(shí)使得差異條逼帶的克隆十分方便。1996年4月,Liang和Pa「dee[4]對(duì)5’端此物進(jìn)行了改進(jìn),引物條數(shù)改為8條,皆帶上Hindlll酶切位點(diǎn)，每條由13個(gè)堿基組成，3"端錨定引物采用3條，也帶上Hindlll酶切位點(diǎn)，每條由18個(gè)堿基纟R成，PCR循環(huán)條件仍采用94°C30sz40°C2minz72°C30sz40個(gè)循環(huán)，最后在72°C延伸7

6、min01998年[5]我們?cè)贚iang和Pardee改進(jìn)的基礎(chǔ)上，對(duì)PCR循壞參數(shù)進(jìn)行了改進(jìn)，即前5個(gè)循環(huán)采用94°C30s,40°C2min,72°C30s,后35個(gè)循環(huán)采用94°C30s,55oC2minz72°C30s,最后在72°C延伸7mino經(jīng)這樣改進(jìn)，既保持了擴(kuò)增效率，又增強(qiáng)了差異條帶的特異性及重復(fù)性，降低了假陽性率。mRNA差異展示具有簡(jiǎn)便、快速、所需起始材料少、同時(shí)可在多個(gè)材料Z問或不同處理材料之間進(jìn)行比較等優(yōu)點(diǎn)，但具有較高頻率的假陽性和短小的差異片段的缺點(diǎn)，給示續(xù)處理帶來一系列問題，雖然此技術(shù)經(jīng)過了一些起改進(jìn)，但這兩個(gè)缺點(diǎn)仍限制著此方法的充分應(yīng)用。二、代表性差示分

7、析代表性弟示分析(representationaldifferenceanalysiszRDA)最早由Lisitsyn等提岀的。1994年，Hubank和Schatz[6]將其應(yīng)用于克隆差異表達(dá)基因，其基木原理是:靶方(Tester/)和驅(qū)動(dòng)方(Driver,D)的cDNA在進(jìn)行差方式分析前均用一種識(shí)別4堿基序列的限制酶作切割處理，形成平均長(zhǎng)度為256bp的cDNA片段代表群，第一次「與D雜交反應(yīng)時(shí)，兩者總量比為1：100,第二次增加到1：40