實(shí)驗(yàn)二常見細(xì)菌種屬的鑒定

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1、實(shí)驗(yàn)二常見細(xì)菌種屬的鑒定一、目的要求二、基本原理三、器材四、操作步驟五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告一、目的要求1、了解常見細(xì)菌種屬的鑒定程序2、掌握細(xì)菌的生理生化指標(biāo)鑒定方法二、基本原理（一）微生物分類鑒定的方法—多相分類法多相分類法：Colwell1970年提出，指利用微生物多種不同的信息，包括表型的、基因型的和系統(tǒng)發(fā)育的信息，綜合研究微生物分類和系統(tǒng)進(jìn)化的過程。多相分類法幾乎包括了現(xiàn)代分類中所有的方面，如傳統(tǒng)分類、化學(xué)分類、分子分類、數(shù)值分類等，被認(rèn)為是目前研究各級(jí)分類單元最有效的手段，可用于所有水平上的分類單元的描述和定義。1、傳統(tǒng)分類法也稱描述分類，主要指以形態(tài)特征、培

2、養(yǎng)特征以及生理生化特征等表觀分類指征，對(duì)微生物分類單元進(jìn)行的描述分類。傳統(tǒng)分類是認(rèn)識(shí)微生物實(shí)際重要性和研究生物進(jìn)化的基礎(chǔ)。是隨著信息數(shù)字化時(shí)代的發(fā)展，根據(jù)微生物分類學(xué)信息，應(yīng)用計(jì)算數(shù)學(xué)原理和技術(shù)輔助定義微生物分類單元的一種方法。主要是向分類學(xué)家提供準(zhǔn)確的、可重復(fù)的、大信息量的處理手段。2、數(shù)值分類3、化學(xué)分類是研究微生物細(xì)胞不同化學(xué)特性，并利用這些特性對(duì)生物個(gè)體進(jìn)行分類和鑒定。由于細(xì)胞化學(xué)成分及分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性好，因此化學(xué)分類是原核微生物系統(tǒng)分類學(xué)的主要方法之一。3、化學(xué)分類的常用方法細(xì)胞（壁）化學(xué)組分分析枝菌酸分析（諾卡氏菌）磷酸類脂分析脂肪酸組分分析醌組分

3、分析全細(xì)胞蛋白SDS-PAGE分析核糖體蛋白雙向凝膠電泳（2D-PAGE）4、分子分類從分子水平上，對(duì)生物個(gè)體的DNA、RNA和蛋白質(zhì)進(jìn)行研究，并根據(jù)獲得的基因型信息對(duì)生物個(gè)體進(jìn)行分類的方法。DNAG+Ｃmol%DNA分子指紋分析DNA-DNA雜交核酸序列分析（16srDNA、ITS等）（二）微生物的生理生化反應(yīng)1、淀粉水解實(shí)驗(yàn)2、糖發(fā)酵試驗(yàn)3、MR（甲基紅）4、V-P（伏-普）1、淀粉水解實(shí)驗(yàn)不同微生物對(duì)不同大分子的水解能力不同，說明它們有著不同的酶系統(tǒng)。淀粉遇到碘液會(huì)產(chǎn)生藍(lán)色，但是細(xì)菌水解淀粉的區(qū)域，用碘測試不再產(chǎn)生藍(lán)色，表明細(xì)菌產(chǎn)生淀粉酶。2、糖發(fā)酵試驗(yàn)

4、糖發(fā)酵試驗(yàn)是常用的鑒別微生物的生化反應(yīng)，在腸道菌的鑒定上尤為重要。絕大多數(shù)細(xì)菌都能利用糖類作為碳源和能源，但在分解糖類物質(zhì)的能力上差別很大。有的能產(chǎn)酸和氣體，有的只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。發(fā)酵產(chǎn)酸時(shí)，溴甲酚紫（pH6.8）變?yōu)辄S色（pH5.2）。氣體的產(chǎn)生可以由倒扣的杜氏小管中有無氣泡來證明。3、MR（甲基紅試驗(yàn)）用來檢測由葡萄糖產(chǎn)生的有機(jī)酸，如甲酸、乙酸、乳酸等。當(dāng)細(xì)菌代謝糖產(chǎn)酸時(shí)，甲基紅試劑會(huì)由橘黃色（6.3）變?yōu)榧t色（4.2），即為甲基紅陽性反應(yīng)。4、V-PVP試驗(yàn)是用來測定某些細(xì)菌利用葡萄糖產(chǎn)生非酸性或中性末端產(chǎn)物的能力，如丙酮酸。此化合物在堿性條件下能被空氣中的

5、氧氣氧化成二乙酰。二乙酰與蛋白質(zhì)中的精氨酸的胍基作用，生成紅色化合物，即為VP試驗(yàn)陽性。菌種枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、普通變形桿菌2、培養(yǎng)基固體淀粉培養(yǎng)基、葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基、乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基等3、儀器或其他用具三、器材淀粉水解試驗(yàn)將固體淀粉培養(yǎng)基溶化后冷卻至50℃，無菌操作制成平板。用記號(hào)筆在平板底步劃成三部分，將枯草、大腸桿菌、變形桿菌等分別劃線接種，并在平板背面標(biāo)注菌種名稱。37℃倒置培養(yǎng)24-48小時(shí)觀察各種細(xì)菌的生長情況。將平板打開蓋子，滴入少量Lugol’s碘液，輕輕旋轉(zhuǎn)，使碘液均勻鋪滿整個(gè)平板觀察菌落周圍有沒有透明圈出現(xiàn)。透明圈和菌

6、落的直徑大小可以初步判斷菌體解淀粉的活性。四、操作步驟2、糖發(fā)酵試驗(yàn)用記號(hào)筆在裝有糖發(fā)酵培養(yǎng)基的試管壁上分別表明培養(yǎng)基名稱和所接種的細(xì)菌菌名。取葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基試管3支，分別接入大腸桿菌、枯草桿菌、普通變形桿菌，對(duì)照不接種。另取乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基試管3支，操作同上。接種后，輕輕搖動(dòng)試管使其混合均勻，防止倒置的小管進(jìn)入氣泡。將接過種的和作為對(duì)照的6支管均置于37℃培養(yǎng)24~48小時(shí)。觀察各試管顏色變化以及杜氏小管有無氣泡。3、MR、VP試驗(yàn)配制蛋白胨水培養(yǎng)基，接種試驗(yàn)菌種。培養(yǎng)48小時(shí)后，將一支葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)物中加入甲基紅試劑2滴，培養(yǎng)基若變?yōu)榧t色者，為陽性，變

7、黃色者為陰性。取另外一支培養(yǎng)48小時(shí)后的葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)物，加入5~10滴40%的KOH，然后加入等量的5%的a-萘酚溶液，用力振蕩，再放入37°溫箱中保溫15~30分鐘，以加快反應(yīng)速度。培養(yǎng)物呈紅色者，為V-P反應(yīng)陽性。記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果P118.1；P120.1；P123.1根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測1、2、3號(hào)菌種分別是何菌？思考題（1）你怎樣解釋淀粉酶是胞外酶而非胞內(nèi)酶？（2）加入某種微生物可以有氧代謝葡萄糖，發(fā)酵試驗(yàn)是什么結(jié)果？（3）為什么大腸桿菌是MR陽性，而枯草桿菌是陰性？這個(gè)實(shí)驗(yàn)，與V-P試驗(yàn)最初底物與最終產(chǎn)物有何異同？為什么會(huì)不同？五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告