資源描述：
《用16S rDNA方法鑒定細(xì)菌種屬.doc》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫(kù)。
1、.......用16SrDNA方法鑒定細(xì)菌種屬一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.掌握16SrDNA對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分類的原理及方法；2.掌握DNA提取、PCR原理及方法、DNA片段回收等實(shí)驗(yàn)操作。二、實(shí)驗(yàn)原理細(xì)菌rRNA（核糖體RNA）按沉降系數(shù)分為3種，分別為5S、16S和23SrRNA。16SrDNA是細(xì)菌染色體上編碼16SrRNA相對(duì)應(yīng)的DNA序列，存在于所有細(xì)菌染色體基因中。16SrDNA鑒定是指用利用細(xì)菌16SrDNA序列測(cè)序的方法對(duì)細(xì)菌進(jìn)行種屬鑒定。包括細(xì)菌基因組DNA提取、16SrDNA特異引物PCR擴(kuò)增、擴(kuò)增產(chǎn)物純化、DNA測(cè)序、序列比對(duì)等
2、步驟。是一種快速獲得細(xì)菌種屬信息的方法?！?6SrDNA是細(xì)菌的系統(tǒng)分類研究中最有用的和最常用的分子鐘，其種類少，含量大（約占細(xì)菌RNA含量的80％），分子大小適中，存在于所有的生物中，其進(jìn)化具有良好的時(shí)鐘性質(zhì)，在結(jié)構(gòu)與功能上具有高度的保守性，素有“細(xì)菌化石”之稱。在大多數(shù)原核生物中rDNA都具有多個(gè)拷貝，5S、16S、23SrDNA的拷貝數(shù)相同。16SrDNA由于大小適中，約1.5Kb左右，既能體現(xiàn)不同菌屬之間的差異，又能利用測(cè)序技術(shù)較容易地得到其序列，故被細(xì)菌學(xué)家和分類學(xué)家接受。16SrRNA的編碼基因是16SrDNA，但是要直
3、接將16SrRNA提取出來(lái)很困難，因?yàn)橐妆粡V泛存在的RNase降解，因而利用16SrDNA鑒定細(xì)菌，其技術(shù)路線如下：細(xì)菌培養(yǎng)液基因組DNA16SrDNA片段連接克隆載體陽(yáng)性克隆鑒定測(cè)序片段回收DNA提取PCR擴(kuò)增細(xì)菌基因組的提?。旱玫桨麅?nèi)可溶物質(zhì)菌體破碎純化DNA分離出DNAPCR的基本原理：PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈
4、DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引.s..............物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過(guò)程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。二、操作步驟1、細(xì)菌基因組DNA提?。?
5、、PCR擴(kuò)增；3、細(xì)菌基因組DNA及PCR產(chǎn)物的電泳檢測(cè)；4、擴(kuò)增片段回收；5、DNA片段測(cè)序。三、結(jié)果處理與分析在回收擴(kuò)增片段時(shí)，紫外燈下條帶呈現(xiàn)綠色熒光，將凝膠中綠色熒光部分切割分離出來(lái)，放入已稱重的2ml離心管中，空的離心管為1.02g，放入回收的凝膠后為1.42g，，則凝膠為400mg，因此加入的BindingBuffer為1200μl。我們小組選用B116Ssequence，以下為制作進(jìn)化樹(shù)過(guò)程：1、根據(jù)B116S基因序列，到NCBI上比對(duì)，確定其種屬（1）NCBI主頁(yè)（.ncbi.nlm.nih.gov/）依次點(diǎn)擊進(jìn)入B
6、LAST（2）選擇nucleotideBLAST.s..............（3）將B1序列復(fù)制到文本，框里ChooseSearchSet處點(diǎn)復(fù)選按鈕others，最后點(diǎn)BLAST（4）點(diǎn)擊BLAST后，數(shù)據(jù)進(jìn)行提交。BLAST結(jié)果如下：.s..............圖中“Evalue”指標(biāo)與其他指標(biāo)不同，它的數(shù)值越小相似程度越高，其他幾個(gè)（如Totlescore）都是數(shù)值越高相似度越高。我組將數(shù)據(jù)按照Querycover從100%開(kāi)始從大到小排列，從不同相似度一共選出14組數(shù)據(jù)。（5）導(dǎo)出數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)導(dǎo)出格式選擇FASTA：（6
7、）選擇大腸桿菌作為外屬，導(dǎo)出大腸桿菌.s..............（6）下載MEG并安裝，我組使用的是MEGA5.02，并將B1序列導(dǎo)入MEG（7）通過(guò)Edit中的Copy及Paste將B1序列和大腸桿菌序列導(dǎo)入我們選中的14個(gè)序列中.s..............（6）選擇W中AlignDNA，然后點(diǎn)擊OK（10）選擇Date中的MEGAFormat，生成meg文件.s..............（11）打開(kāi).meg文件.s..............（11）生成進(jìn)化樹(shù)（12）導(dǎo)出文件，我組導(dǎo)出PDF格式.s..........
8、....2、進(jìn)化樹(shù)B1應(yīng)該屬于Proteus（變形桿菌屬）電泳圖譜：.s..............從右數(shù)第四個(gè)條帶為本組電泳條帶，條帶清晰且明亮，無(wú)明顯拖尾以及彌散，表明DNA提取和PCR擴(kuò)增非常順利，所得目的片段完整，數(shù)量較多。四
