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1、實(shí)驗(yàn)九實(shí)驗(yàn)九新城疫病毒的雞胚培養(yǎng)新城疫病毒的雞胚培養(yǎng)與病毒滴度檢測與病毒滴度檢測揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院成大榮成大榮2009年5月4日星期一一、目的要求一、目的要求1.1.掌握雞胚接種的掌握雞胚接種的常規(guī)常規(guī)方法;方法;2.2.學(xué)習(xí)學(xué)習(xí)NDVNDV的分離培養(yǎng)及其鑒定方法。的分離培養(yǎng)及其鑒定方法。二、背景知識介紹二、背景知識介紹1.1.病毒的雞胚培養(yǎng)病毒的雞胚培養(yǎng)①①雞胚雞胚是正在發(fā)育的活體是正在發(fā)育的活體::??組織分化程度低;??細(xì)胞代謝旺盛;??適于許多病毒的生長增殖,尤其是禽類病毒。②②雞胚培養(yǎng)的雞胚培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn):優(yōu)點(diǎn):??來源充足;??價格低廉;??操作簡單
2、,無需特殊設(shè)備;??易感病毒譜較廣;??對接種的病毒不產(chǎn)生抗體。③③雞胚培養(yǎng)的雞胚培養(yǎng)的缺點(diǎn):缺點(diǎn):??非SPF雞胚,可能含有某些家禽病毒的母源抗體,甚至還可能帶有雞白痢沙門氏菌、支原體、雞白血病病毒、雞貧血病毒等。④④雞胚接種的方法:雞胚接種的方法:??尿囊腔接種:??絨毛尿囊膜接種??卵黃囊接種??羊膜腔接種??靜脈接種④④雞胚接種的方法:雞胚接種的方法:??尿囊腔接種??絨毛尿囊膜接種:??卵黃囊接種??羊膜腔接種??靜脈接種④④雞胚接種的方法:雞胚接種的方法:??尿囊腔接種??絨毛尿囊膜接種??卵黃囊接種:??羊膜腔接種??靜脈接種④④雞胚接種的方法:雞胚接種的方
3、法:??尿囊腔接種??絨毛尿囊膜接種??卵黃囊接種??羊膜腔接種:??靜脈接種④④雞胚接種的方法:雞胚接種的方法:??尿囊腔接種??絨毛尿囊膜接種??卵黃囊接種??羊膜腔接種??靜脈接種:2.2.新城疫病毒新城疫病毒①副粘病毒科/副粘病毒亞科/禽腮腺炎病毒屬。②新城疫的病原體。③形態(tài):??病毒子多呈球形;??單股負(fù)股RNA;??核衣殼螺旋形對稱;??有囊膜;??囊膜表面有纖突。④血凝性:可凝集人、雞、豚鼠和小白鼠的紅細(xì)胞。⑤病毒分離培養(yǎng):9~11日齡雞胚尿囊腔接種。三、實(shí)驗(yàn)材料三、實(shí)驗(yàn)材料1.1.常規(guī)接種工具:注射器、打孔器、酒精燈等;2.2.待接種的新城疫病毒材料;3.
4、3.9~11日齡雞胚(1個/人);4.4.滅菌生理鹽水;5.5.其他:??鑷子、照蛋器;??酒精棉球、碘酊棉球;??固體石蠟;??滅菌瓶子、滅菌吸管等。四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容以尿囊腔接種為例,介紹新城疫病毒的接種方法:以尿囊腔接種為例,介紹新城疫病毒的接種方法:1.1.照胚:照胚:取9~12日齡發(fā)育良好的雞胚,觀察氣室及胚胎位置,標(biāo)出氣室底邊,在無大血管處標(biāo)出尿囊腔注射部位。2.2.消毒消毒??氣室向上放置雞胚于卵架上;??先后用碘酊和酒精棉球消毒蛋殼所標(biāo)記的位置。距氣室底邊0.5cm3.3.打孔打孔??在所標(biāo)記注射部位用剪刀尖端打孔;??注意用力要穩(wěn),恰好使蛋殼打通而
5、不傷及殼膜。4.4.注入病毒材料注入病毒材料??用1mL注射器抽取接種物;??針頭垂直刺入注射部位1-1.2cm即達(dá)尿囊腔內(nèi);??注入待接種的新城疫病毒:接種量為0.1~0.2mL。5.5.封孔封孔??用熔好的石蠟或消毒膠布封閉注射孔。6.6.孵育與觀察孵育與觀察??氣室朝上于37℃溫箱中孵育;??以后每天檢卵1~2次。??棄去24h內(nèi)的死亡雞胚:––機(jī)械損傷、細(xì)菌或霉菌污染等引起。7.7.病毒的收獲與雞胚的觀察病毒的收獲與雞胚的觀察①收集24h后死亡雞胚,置4℃冰箱過夜,以免收獲時流血;②取出冷卻的雞胚,消毒氣室端卵殼表面;③用鑷子擊破氣室部卵殼并去除殼膜,撕破絨毛尿囊
6、膜;④以眼科鑷鑷住絨毛尿囊膜,用吸管吸取尿囊液,置無菌容器中保存?zhèn)溆?。一般能尿囊?-10mL。⑤取出雞胚胎,于平皿內(nèi)觀察胚胎有無病理變化,如出血、蜷縮、侏儒胚等。8.8.新城疫病毒滴度的檢測新城疫病毒滴度的檢測血凝試驗(yàn)(血凝試驗(yàn)(HAHA))??凡能使雞紅細(xì)胞完全凝集的病毒最高稀釋倍數(shù),稱為該病毒的血凝滴度。六、思考題六、思考題1.1.雞胚接種過程中,應(yīng)該注意的問題?雞胚接種過程中,應(yīng)該注意的問題?2.2.接種病毒后,接種病毒后,24h24h內(nèi)雞胚死亡原因?內(nèi)雞胚死亡原因?3.3.如何判斷新城疫病毒的血凝滴度?如何判斷新城疫病毒的血凝滴度?4.4.臨床上還有哪些病毒具有
7、血凝性?臨床上還有哪些病毒具有血凝性?