一步定量法TAKARA-onestep SYBR RT-PCR kit

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1、CodeNo.RR086A研究用OneStepSYBR?PrimeScript?RT-PCRKitII（PerfectRealTime）說明書v201307Da目錄內(nèi)容頁碼●制品說明1●試劑盒原理1●制品內(nèi)容3●保存3●特長(zhǎng)3●使用注意3●操作方法4●實(shí)驗(yàn)例8●附錄8●引物設(shè)計(jì)說明9●關(guān)聯(lián)產(chǎn)品10●制品說明本制品是采用SYBR?GreenI*1,2嵌合熒光法進(jìn)行OneStepRT-PCR反應(yīng)的專用試劑。使用本制品進(jìn)行RealTimeRT-PCR反應(yīng)可在同一反應(yīng)管內(nèi)連續(xù)進(jìn)行，操作簡(jiǎn)單，并能有效防止污染。本反應(yīng)體系

2、由于可以對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)，大大提高了檢測(cè)靈敏度，并省略了PCR反應(yīng)后的電泳步驟，非常適合于RNA病毒等微量RNA的檢測(cè)。制品中使用了最適合于RealTimeRT-PCR的反轉(zhuǎn)錄酶PrimeScriptRTase和高效的PCR熱啟動(dòng)酶TaKaRaExTaqHS，具有高擴(kuò)增效率和高擴(kuò)增特異性，能進(jìn)行穩(wěn)定的RealTimeOneStepRT-PCR反應(yīng)。本制品的Buffer經(jīng)過改良，使反應(yīng)的特異性比使用OneStepSYBR?PrimeScriptRT-PCRKit（PerfectRealTime）（CodeN

3、o.RR066A）更高。另外，反應(yīng)使用的所有酶都配制成了EnzymeMix的形式，使操作更加方便簡(jiǎn)單。適用的RealTimePCR儀器*3?ABIPRISM?7000/7700,7300/7500/7500FastRealTimePCRSystem(LifeTechnologies)?LightCycler?(RocheDiagnostics)等?ThermalCyclerDiceRealTimeSystemII(CodeNo.TP900/TP960)*1：SYBR?GreenI是經(jīng)MolecularProbe

4、sInc.許可作為研究試劑使用，SYBR?是MolecularProbesInc.的注冊(cè)商標(biāo)（美國(guó)和歐洲）。*2：進(jìn)行TaqMan?探針法的RealTimeOneStepRT-PCR反應(yīng)時(shí)推薦使用OneStepPrimeScriptRT-PCRKit(PerfectRealTime)(CodeNo.RR064A)。（TaqMan?是RocheMolecularSystems的注冊(cè)商標(biāo)。The5'nucleaseprocessiscoveredbypatentsownedbyRocheMolecularSyste

5、msInc.andF.Hofmann-LaRocheLtd.Purchaseoftheproductdoesnotprovidealicensetousethispatentedtechnology.）*3:使用SmartCycler?System/SmartCycler?IISystem(Cepheid)(SmartCycler?是Cepheid的?注冊(cè)商標(biāo))時(shí)，建議使用OneStepSYBRPrimeScriptRT-PCRKit(PerfectRealTime)(CodeNo.RR066A)?！裨噭┖性?/p>

6、本制品首先使用反轉(zhuǎn)錄酶PrimeScriptRTase將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再以cDNA為模板使用TaKaRaExTaqHS在同一反應(yīng)管內(nèi)連續(xù)進(jìn)行RealTimePCR擴(kuò)增反應(yīng)（使用SYBR?GreenI嵌合熒光法監(jiān)測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的生成）。1.PCRPCR法是以微量DNA進(jìn)行目的片段擴(kuò)增的方法。通過DNA鏈的熱變性、引物退火、DNA聚合酶作用下引物的延伸三個(gè)步驟循環(huán)往復(fù)，可在短時(shí)間內(nèi)擴(kuò)增DNA達(dá)100萬倍以上。本制品中的DNA聚合酶由于使用了改良后的TaKaRaExTaqHS，從而抑制在調(diào)制反應(yīng)液等低條件下由

7、引物產(chǎn)生的非特異性退火或引物二聚體引起的非特異性擴(kuò)增，大大提高PCR擴(kuò)增靈敏度。2.RT-PCRRNA不能作為模板直接用于PCR的擴(kuò)增，但是可以通過反轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)合成的cDNA對(duì)RNA進(jìn)行分析，即RT-PCR技術(shù)，可對(duì)RNA進(jìn)行高質(zhì)量檢測(cè)。本試劑盒使用OneStepRT-PCR，實(shí)驗(yàn)原理如下：先使用特異性引物（反向）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增，再以合成的cDNA為模板，以特異性引物（正向、反向）進(jìn)行PCR反應(yīng)。（不能使用隨機(jī)引物和OligodT引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。）-1-OneStepRT-PCR的原

8、理3.熒光檢測(cè)法[嵌合熒光法]在反應(yīng)體系中加入與雙鏈DNA結(jié)合便可發(fā)出熒光的熒光染料SYBR?GreenI，通過檢測(cè)PCR反應(yīng)液中的熒光信號(hào)強(qiáng)度，可以對(duì)目的基因進(jìn)行準(zhǔn)確定量，同時(shí)還可以測(cè)定擴(kuò)增目的DNA片段的融解溫度。Primer1．熱變性Polymerase2．引物退火3．延伸反應(yīng)-2-●制品內(nèi)容（50μl反應(yīng)×100次）1.2×OneStepSYBR?RT-PCRBuffer4*1