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《H9亞型禽流感病毒SYBR GreenⅠ熒光定量RT-PCR法檢測(cè)方法的建立-論文.pdf》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫(kù)。
1、青島農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)30(3)：195～199，2013JournalofQingdaoAgriculturalUniversity(NaturalScience)文章編號(hào)：1674—148X(2013)03—0195一O5H9亞型禽流感病毒SYBRGreenI熒光定量RT—PCR法檢測(cè)方法的建立徐守振，尹燕博(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東青島266109)摘要：RT—PCR擴(kuò)增H9亞型禽流感病毒(AIV(H9))的HA基因保守片段，將其克隆到pMD18一T載體，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確作為陽(yáng)性質(zhì)粒。以陽(yáng)性質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品，建立SYBRGree
2、nI熒光定量RT—PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，該方法靈敏性可達(dá)74．3copies／~L，且特異性好、重復(fù)性佳。SYBRGreenI實(shí)時(shí)熒光定量RT—PCR方法為H9亞型禽流感的病原的快速診斷和病毒的定量分析提供重要手段。關(guān)鍵詞：H9亞型禽流感病毒；HA基因；SYBRGreenI熒光定量PCR中圖分類號(hào)：$852．65文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：ADOI：10．3969／J．ISSN．1674—148X．2013．03．009EstablishmentofSYBRGreenIReal-timeRT—PCRDetectingH9AvianInfluenzaVi
3、rusXUShouzhen。YINYanbo(CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，QingdaoAgriculturalUniversity，Qingdao266109，China)Abstract：ConservativefragmentofHAgeneofAIV(H9)wasamplifiedbyRT—PCRandclonedintopMD18一Tvector．Aftersequencing，thepositiverecombinantplasmidwasacquiredandusedt
4、oestablishstandardcurveoftheSYBRGreenIreal—timeRT-PCR．Theresultsshowedthatthesensitivitywassogoodthat74．3copies／~Loftheviruscontentcouldbedetected．Furthermore，thismethodwashighlyspe—cificandreproducible．ItisconcludedthattheSYBRGreenIreal—timeRT—PCRisagoodtechnologyforpathog
5、enicdiagnosisandvirusquantificationofAIV(H9)．Keywords：H9N2avianinfluenzavirus；HAgene；SYBRGreenIReal—timeRT—PCR禽流感(avianinfluenza，AI)是由于正黏病毒科養(yǎng)禽生產(chǎn)造成的巨大影響和損失，如何快速準(zhǔn)確地流感病毒屬的A型流感病毒(AIV)引起的一種禽檢測(cè)AIV(H9)已成為防控的關(guān)鍵。類或人類感染的傳染病。根據(jù)AIV的血凝素(HA)禽流感AI(H9)與新城疫(ND)、雞傳染性支氣和神經(jīng)氨酸酶(NA)抗原差異，AIV可分為16
6、個(gè)管炎(IB)臨床癥狀相似，給AI(H9)的診斷造成了HA亞型(H1～H16)和9個(gè)NA亞型(N1～極大困難。傳統(tǒng)的病毒分離和血清學(xué)診斷方法費(fèi)時(shí)N9)口]。H9亞型AIV(AIV(H9))于1966年在美費(fèi)力，不利于AIV(H9)的快速診斷；而常規(guī)RT—國(guó)威斯康星在火雞中首次發(fā)現(xiàn)，自1999年以來(lái)也出PCR方法由于實(shí)驗(yàn)室污染等原因存在一定的假陽(yáng)現(xiàn)AIV(H9)多次感染人的報(bào)道。目前，AIV(H9)性，且不能對(duì)病毒進(jìn)行定量分析_3]。近年發(fā)展起來(lái)在我國(guó)廣泛存在，可引起雛雞死亡，生產(chǎn)性能下降，的實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-timePCR)技術(shù)以
7、其快常與其他病原(如大腸桿菌)混合感染，給養(yǎng)禽業(yè)造速簡(jiǎn)單、高度靈敏和強(qiáng)特異性等優(yōu)點(diǎn)廣泛應(yīng)用到基成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失I2]。鑒于AIV(H9)對(duì)人類健康和因表達(dá)分析，并引用到AIV的定性和定量檢收稿日期：2013—07—09基金項(xiàng)目：青島市公共領(lǐng)域科技支撐計(jì)劃(10-3-3—17一nsh)；山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系家禽創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目作者簡(jiǎn)介：徐守振(1977一)，男，山東沂水人，副教授，博士，主要從事禽病防治研究。青島農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)測(cè)[4]，但Real—timePCR方法用于檢測(cè)AIV(H9)10×Buffer3肚L，MgC123L，dN
8、TP(10mmol／L)臨床樣品的研究很少。本試驗(yàn)旨在建立快速檢測(cè)臨2．5FL，rTaq酶0．5FL，上下游引物各0．5FL，反轉(zhuǎn)床病料中AIV(H9)的SYBRG
