菌種地復(fù)蘇傳代及保存實(shí)用標(biāo)準(zhǔn)程序

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1、實(shí)用標(biāo)準(zhǔn)菌種的復(fù)蘇傳代及保存標(biāo)準(zhǔn)程序目的：建立菌種的復(fù)蘇、傳代及保存標(biāo)準(zhǔn)程序。范圍：適用于檢定用菌種的復(fù)蘇、傳代及保存的操作。職責(zé)：質(zhì)管部生物測(cè)定人員對(duì)本規(guī)程的實(shí)施負(fù)責(zé)。內(nèi)容：菌種的復(fù)蘇與傳代操作均應(yīng)在生物檢定室陽(yáng)性對(duì)照間或?qū)Ｓ贸瑑艄ぷ髋_(tái)內(nèi)進(jìn)行。操作中使用過(guò)的滴管、吸管及菌種管等均需放入消毒液中浸泡，試驗(yàn)結(jié)束后經(jīng)121℃30分鐘高溫滅菌處理。1.菌種的復(fù)蘇1.1凍干菌種的復(fù)蘇檢定用標(biāo)準(zhǔn)菌種，由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，為冷凍干燥菌種(0代)。使用前需將其復(fù)蘇。1.1.1準(zhǔn)備：①用具：滅菌1ml滴管、滅菌雙碟、滅菌鑷子、砂輪、酒精燈、接種環(huán)。②培養(yǎng)基：根據(jù)菌種的性質(zhì)選擇合適的液體培養(yǎng)基

2、（營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基或改良馬丁培養(yǎng)基）、營(yíng)養(yǎng)瓊脂（或改良馬丁瓊脂）斜面數(shù)支。③消毒液：75%酒精、碘酒、0.1%新潔爾滅或84消毒液等。1.1.2操作：1.1.2.1將準(zhǔn)備妥的冷凍菌種管、滅菌滴管、滅菌雙碟及鑷子、培養(yǎng)基移入工作臺(tái)。1.1.2.2用砂輪將凍干菌種管頸部挫出刻痕，再75%酒精棉擦凈菌種管外壁，放在滅菌雙碟內(nèi)待干。1.1.2.3點(diǎn)燃酒精燈，將菌種安瓿的封口一端在火焰上灼燒紅熱，用滅菌滴管吸取液體培養(yǎng)基少許，滴在灼熱的菌種安瓿封口一端，使其驟冷而炸裂。1.1.2.4取滅菌鑷子，在火焰旁，將炸裂的管口打開(kāi)后，把菌種安瓿放入滅菌雙碟內(nèi)。1.1.2.5另取一支滅菌滴管，在火焰旁吸取適用

3、液體培養(yǎng)基少許，加至菌種管底部，將文案大全實(shí)用標(biāo)準(zhǔn)凍干菌攪動(dòng)促使溶解，隨即吸出管內(nèi)菌液，接種至液體培養(yǎng)基內(nèi)。用接種環(huán)取菌液劃線接種于瓊脂斜面培養(yǎng)基上。1.1.2.6將已接種的液體培養(yǎng)基及瓊脂斜面培養(yǎng)基置規(guī)定溫度下（一般細(xì)菌在30~35℃，真菌在23~28℃）培養(yǎng)24h。1.1.2.7取出培養(yǎng)物（第1代），仔細(xì)觀察菌苔形態(tài)、有無(wú)雜菌，必要時(shí)涂片、革蘭氏染色鏡檢，若呈典型菌落即可應(yīng)用。如發(fā)現(xiàn)菌型不典型，可進(jìn)行平板分離單菌落。1.2為保證工作用菌株的傳代次數(shù)不超過(guò)5代，并減少購(gòu)買凍干菌種的次數(shù)，可在對(duì)凍干菌種復(fù)蘇的同時(shí)制備部分菌懸液（第1代）冷凍保存，并將此凍存菌液復(fù)蘇后的第2代培養(yǎng)物凍存保

4、藏。1.2.1準(zhǔn)備：①凍存保護(hù)液（40%無(wú)菌甘油）及滅菌凍存管。②細(xì)菌凍存液：由液體培養(yǎng)基與凍存保護(hù)液按1：1比例混勻制成。1.2.2按1.1.2.1~1.1.2.4操作，將凍干菌復(fù)溶后，吸取菌懸液加入到細(xì)菌凍存液中，混勻。1.2.3按1ml/管的量分裝至滅菌凍存管中，密閉。標(biāo)明菌名、編號(hào)及凍存日期等。置-20℃或-80℃條件下冷凍保存。1.2.4制備第2代凍存菌懸液時(shí)，可用接種環(huán)直接刮取第1代凍存菌懸液復(fù)蘇后轉(zhuǎn)種至瓊脂斜面或平板培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的純菌落，再接種至細(xì)菌凍存液中，混勻后按1.2.3凍存。1.3凍存菌懸液的復(fù)蘇：1.3.1準(zhǔn)備：①用具：滅菌1ml滴管、酒精燈、接種環(huán)。②培養(yǎng)基：

5、根據(jù)菌種的特性選擇適宜的液體培養(yǎng)基（如營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基10ml、硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基12ml或改良馬丁培養(yǎng)基10ml等）、瓊脂斜面或平板培養(yǎng)基。③消毒液：75%酒精、0.1%新潔爾滅或84消毒液等。1.3.2操作：1.3.2.1從低溫冰柜中取出菌種凍存管，室溫下放置使其自然解凍。文案大全實(shí)用標(biāo)準(zhǔn)1.3.2.2將解凍后菌種管及滅菌滴管、液體培養(yǎng)基等移入工作臺(tái)。1.3.2.3用75%酒精棉球擦拭菌種凍存管外壁，稍干。1.3.2.4點(diǎn)燃酒精燈，在火焰旁打開(kāi)菌種凍存管蓋，用一支滅菌滴管吸取解凍的菌懸液，接種至10ml液體培養(yǎng)基中（生孢梭菌需接種至12ml硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中）?；蛴媒臃N環(huán)取菌懸

6、液劃線接種于瓊脂斜面或平板培養(yǎng)基上。1.3.2.5將用過(guò)的滴管和菌種管投入消毒液內(nèi)浸泡，接種環(huán)在火焰上灼燒。1.3.2.6將上述接種后的培養(yǎng)基在規(guī)定溫度下培養(yǎng)（細(xì)菌在30~35℃恒溫培養(yǎng)18-24小時(shí)，真菌在23~28℃恒溫培養(yǎng)24-48小時(shí)，黑曲霉*培養(yǎng)5~7天）。1.3.2.7仔細(xì)觀察培養(yǎng)物：如呈典型菌落即可作為日常工作中使用的菌種，注明菌名、編號(hào)、代次和接種日期后，置2~8℃冰箱內(nèi)保存；如發(fā)現(xiàn)菌苔形狀不典型，可進(jìn)行平板分離單菌落。1.3.2.8注意：已解凍的凍存管不可再凍存。2.菌種的接種、傳代2.1.準(zhǔn)備①用具：接種環(huán)、酒精燈。②培養(yǎng)基：營(yíng)養(yǎng)瓊脂或改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基或適宜的

7、液體培養(yǎng)基。培養(yǎng)基應(yīng)新鮮制備，如斜面已干縮，無(wú)冷凝水，則不宜再使用。③消毒液：75%酒精、0.1%新潔爾滅或84消毒液。④菌種：根據(jù)2010年版《中國(guó)藥典》的要求，傳代次數(shù)（n）應(yīng)不超過(guò)4代。2.2將冰箱中取出的菌種斜面，在室溫放置30分鐘，待溫度平衡后再移入接種室內(nèi)或超凈工作臺(tái)。2.3點(diǎn)燃酒精燈，將菌種管與接種管持在左手拇指、食指與中指之間，試管口斜向上，兩試管口平齊靠近火焰旁。2.4用右手在火焰旁轉(zhuǎn)動(dòng)兩管的棉塞，以便接種時(shí)易拔取，再以右手持