冷凍切片HE染色操作步驟-20160622.pdf

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1、溶液配制：(1)1%鹽酸酒精：99份無水酒精加上1份濃鹽酸(2)70%、80%、90%、100%乙醇、二甲苯操作步驟：一、切片：將組織塊平放于軟塑瓶蓋或特制小盒內(nèi)（直徑約2cm），如組織塊小可適量加OCT包埋劑浸沒組織，然后將特制小盒緩緩平放入盛有液氮的小杯內(nèi)，當(dāng)盒底部接觸液氮時即開始?xì)饣序v，此時小盒保持原位切勿浸入液氮中，大約10-20s組織即迅速冰結(jié)成塊。在制成凍塊后，即可置入恒冷箱切片機(jī)冰凍切片。若需要保存，應(yīng)快速以鋁箔或塑料薄膜封包，立即置入-80℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?．固定：樣品托上涂一層OCT包埋膠，將速

2、凍組織置于其上，4℃冰箱預(yù)冷5-10min讓OCT膠浸透組織。取下組織置于錫箔或者玻片上，樣品托速凍。組織置于樣品托上，其上再添一層OCT膠，以完全覆蓋為宜，速凍架（PE）上30min。4.切片：恒溫冰凍切片機(jī)為較理想的冰凍切片機(jī)，其基本結(jié)構(gòu)是將切片機(jī)置于低溫密閉室內(nèi)，故切片時不受外界溫度和環(huán)境影響，可連續(xù)切薄片至5-10μm。切片時，低溫室內(nèi)溫度以-15℃～-20℃為宜，溫度過低組織易破碎，抗卷板的位置及角度要適當(dāng)，載玻片附貼組織切片，切勿上下移動。切好室溫放置30min后，入4℃丙酮固定5~10min，烘箱干燥

3、20min。PBS洗5min×3。進(jìn)行抗原熱修復(fù)，微波熱修復(fù)也可，室溫自然冷卻?？捎?%H2O2孵育5~10min，消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。1二、染色：1.蘇木素染色：玻片浸沒于蘇木素的染色缸中3min，用自來水沖洗至其表面干凈即可；2.顯微鏡觀察：細(xì)胞核著色呈深紫色，細(xì)胞核呈淺藍(lán)色即可；若著色淺，此過程可反復(fù)。3.玻片浸沒于1%的鹽酸酒精染色缸內(nèi)2s，快速取出，用自來水沖洗干凈。4.顯微鏡觀察：細(xì)胞核呈紫藍(lán)色，細(xì)胞漿呈無色即可。5.返藍(lán):自來水返藍(lán)或者1%氨水返藍(lán)，返藍(lán)至細(xì)胞核呈藍(lán)色；6.伊紅染色：將玻片浸沒

4、于伊紅的染色缸中1min，用自來水沖洗至其表面干凈即可。7.顯微鏡觀察：細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色，細(xì)胞漿呈現(xiàn)紅色即可。8.透明（可選做）利用梯度酒精和二甲苯對染色完的切片進(jìn)行透明處理，可以延長玻片的保存時間。70%乙醇(10s)—80%乙醇(10s)—90%乙醇(30s)—無水乙醇(1min)—二甲苯I(1min)—二甲苯II(1min)9.中性樹膠封片，擇日拍照。2